MiR-22作为自噬和凋亡的天关增强5-FU的药物敏感性

摘要

在消化道恶性肿瘤中，结直肠癌是高发的恶性肿瘤。近年来随着中国城市化进程加快和居民生活方式日趋西方化，结直肠癌不仅在消化道肿瘤中发病率越来越高，在恶性肿瘤中发病率也高居前位;全球对结直肠癌的研究投入了大量的资金，截止2012年10月，也取得了大量的研究成果，国际上有关结直肠癌的文献将近15000篇，明确了结直肠癌是个多基因、多步骤演进的复杂过程，但结直肠癌的早期诊断水平低下，其发病机制仍未明确，总体死亡率仍然高居不下。另外，结直肠癌化疗耐药仍是其治疗的一个难题。因此，明确结直肠癌发病机制以及寻找更为有效的治疗手段提高治愈率乃至根治结直肠癌具有十分重大的临床意义和社会经济效益。
　　 自噬是由自噬基因调控的真核细胞降解细胞内细胞器和蛋白质的多步骤多程序高度进化保守的过程。其特征是形成自噬体，自噬体与溶酶体融合后被消化，并为细胞提供再循环的物质和能源。自噬涉及感染、免疫、衰老、肿瘤、神经退化性疾病、心脏病等疾病。自噬具有双向作用，它既对生命体起到保护作用，也促进疾病的发生发展。自噬在肿瘤形成发展和治疗预后过程中，起到了十分重要的作用。非编码RNA是不编码蛋白质的RNA，通过基因转录后调控、剪切和修饰在很多生命活动中均起着举足轻重的作用。非编码的RNA中的MicroRNA是一类21～23 nt的小RNA，通过靶向mRNA的3端非编码区域，阻遏其翻译。MicroRNA广泛参与了许多生物学行为包括自噬凋亡和许多疾病如肿瘤。
　　 我们用饥饿诱导自噬，并用免疫印迹、间接免疫荧光、EGFP-LC3-Ⅱ和电镜等方法证实了自噬被诱导;研究发现，miR-22与自噬发生水平呈负相关，当miR-22过表达载体转染结直肠癌细胞SW620，细胞自噬水平下降，而miR-22抑制体转染结直肠癌细胞RKO后，自噬水平上升，上述实验结果从正反两面验证了miR-22抑制结直肠癌细胞自噬。为了研究miR-22的临床治疗意义，免疫印迹、台盼兰染色结果显示，过表达miR-22增强了5-FU对结直肠癌细胞SW620的凋亡水平，相反在下调miR-22后的RKO细胞中凋亡水平下降。我们在稳定表达miR-22抑制体的RKO细胞中干扰ATG5抑制自噬后，免疫印迹、台盼兰染色发现miR-22可通过抑制自噬同时增加凋亡来增强结直肠癌细胞对5-FU的药物敏感性。实验结果也表明miR-22能增加对5-FU耐药的结直肠癌细胞系HCT-8/5FU的凋亡水平和死亡率。通过在线软件预测到BTG1的3'-UTR是miR-22的直接靶标，荧光素酶活性和免疫印迹证实了miR-22靶标BTG1抑制自噬。最后体内实验也表明，miR-22通过抑制自噬上调凋亡进而增强了结直肠癌细胞对5-FU的药物敏感性。
　　 通过体内外实验，我们得出以下结论:
　　 1)miR-22通过靶向抑制其靶基因BTG1而抑制结直肠癌细胞自噬。
　　 2) miR-22通过抑制自噬同时上调凋亡而增强5-FU的药物敏感性。
　　 我们首次在结直肠癌细胞中发现了miR-22一个新的功能，miR-22作为自噬与凋亡的开关，通过靶标BTG1的3'-UTR区转录后沉默其表达进而抑制自噬，上调结直肠癌细胞系的凋亡从而增强了5-FU的化疗效果，从而为临床治疗提供了新的分子靶向治疗方法。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语

1 引言

2 仪器设备和试剂

2．1 仪器设备

2．2 主要生物化学试剂

3 缓冲液和培养液的配制方法

3．1 蛋白免疫印记缓冲液

3．2 基因克隆缓冲液

3．3 细胞培养液

4 材料和方法

5 实验结果

6 讨论

7 结论

参考文献

综述 自噬、凋亡与肿瘤

作者简历及在读期间所取得科研成果