缺氧缺糖诱导小鼠小胶质细胞株BV2细胞释放前B细胞克隆增强因子PBEF

摘要

研究背景:
　　前B细胞克隆增强因子(Pre-B-cell colony-enhancing factor, PBEF)又被称为内脏脂肪素(visfatin)和尼克酰胺磷酸核糖转移酶(NicotinamidePhosphoribosyltransferase，Nampt)。PBEF因具有细胞因子、脂肪因子、酶等多种作用参与机体的一系列生命活动过程而受到广泛的关注。
　　研究发现，PBEF在体内广泛表达，并可被多种细胞释放，且PBEF的释放是细胞类型依赖的。在外周，PBEF作为一种新型的炎症介质，被淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等外周炎症细胞释放。在中枢，PBEF主要表达于神经元和血管内皮细胞，胶质细胞不表达PBEF;大鼠脑缺血后，星形胶质细胞仍无PBEF表达，但在脑缺血亚急性期小胶质细胞可大量表达PBEF。小胶质细胞是脑内介导免疫、炎症反应最主要的效应细胞，其对中枢神经系统起免疫监视的作用，且小胶质细胞具有与单核细胞、巨噬细胞相同的来源。因而，我们推测在一定条件下小胶质细胞可诱导表达并释放PBEF，而小胶质细胞释放的PBEF作为脑内新型的炎症介质可促进和/或维持中枢炎症。
　　然而，目前PBEF的释放机制仍未阐明。研究发现，PBEF缺少一般分泌蛋白具备的N端出胞信号肽序列，其释放不遵循经典的内质网-高尔基体依赖的释放途径。因而，本课题关注以下问题:1）小胶质细胞能否诱导表达并释放PBEF?2）小胶质细胞释放PBEF涉及哪些途径？3）小胶质细胞释放PBEF受哪些因素的调节？
　　研究目的:
　　观察缺糖缺氧（oxygen-glucose deprivation/recovery, OGD/R）诱导小鼠小胶质细胞株BV2细胞表达并释放新型炎症因子PBEF的作用，并初步探讨BV2细胞释放PBEF的途径及影响因素。
　　研究方法:
　　BV2细胞经缺糖缺氧恢复（oxygen-glucose deprivation/recovery, OGD/R）模拟脑缺血处理后，分别以western blotting和ELISA检测PBEF在BV2细胞内的表达和PBEF的释放，RT-PCR检测PBEFmRNA表达变化;以经典的内质网-高尔基体依赖的蛋白分泌途径抑制剂及非经典的蛋白分泌途径抑制剂预处理BV2细胞后，再以OGD1 h/R12 h处理细胞，初步分析BV2细胞释放PBEF所涉及的途径;以免疫荧光染色确定PBEF在BV2细胞内的分布，并以同样方法确定表达了荧光蛋白特异标记的溶酶体（Lamp1）、线粒体(MitoRed)、自噬体(LC3)的BV2细胞在OGD/R前后，PBEF与各细胞器的共定位情况，从而进一步确证PBEF的释放途径;最后，分析常见的影响细胞胞吐的因素（ATP、钙离子浓度）对OGD/R诱导BV2细胞释放PBEF的影响。
　　研究结果:
　　第一部分缺糖缺氧可诱导BV2细胞释放PBEF
　　OGD1小时/恢复12-24小时(OGD1h/R12-24 h)，可诱导BV2细胞释放PBEF明显增高，并伴有细胞内PBEF的蛋白量的下降，PBEF的mRNA表达上调;OGD/R诱导的PBEF的释放不受经典的蛋白分泌途径抑制剂BFA、自噬抑制剂3-MA的影响，而NH4Cl处理、ABCA1转运体抑制剂Glyburide及DIDS均可剂量依赖性抑制PBEF的释放;免疫荧光染色结果表明，PBEF主要分布于BV2细胞胞浆，核内也有少量分布，PBEF与溶酶体、线粒体有共定位，OGD/R处理后，PBEF向胞膜聚集;外钙内流及胞外ATP浓度升高能进一步增强OGD/R诱导的PBEF释放，且P2X7受体抑制剂BBG、PPADS可剂量依赖性抑制OGD/R诱导的PBEF释放而ATP降解酶Apyrase可逆转这一过程。
　　第二部分缺糖缺氧诱导BV2细胞释放PBEF的过程中伴有其他细胞因子的释放
　　缺糖缺氧1h/2h/4h恢复不同时间，随着时间延长，BV2细胞释放PBEF增多，并伴随有TNF-α、IL-6等细胞因子的释放。这提示细胞释放的PBEF与其他炎症细胞因子之间存在相互作用的可能。
　　第三部分缺糖缺氧诱导BV2细胞释放的PBEF对BV2细胞本身活性的影响
　　正常条件下，胞外的PBEF对BV2细胞活性无明显影响，但在缺糖缺氧条件下，胞外PBEF浓度升高可逆转缺糖缺氧导致的BV2细胞活性的下降，且PBEF浓度越高保护作用越明显。
　　结论:
　　1.缺糖缺氧可诱导BV2细胞释放PBEF; BV2细胞释放PBEF部分通过ABCA1转运体、溶酶体途径，外钙内流及胞外ATP浓度增高可增强OGD/R诱导的PBEF释放，且P2X7受体参与调节这一过程。
　　2.缺糖缺氧诱导BV2细胞释放PBEF及其他炎症因子，提示PBEF与其他炎症因子之间存在相互作用的可能。
　　3.缺糖缺氧条件下，胞外PBEF对BV2细胞具有保护作用。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

1．引言

2．实验材料

2．1 实验细胞株

2．2 实验试剂

2．3 实验仪器

2．4 实验用溶液配制

3．实验方法

3．1 细胞培养

3．2 缺糖缺氧(OGD)处理

3．3 LDH释放检测

3．4 免疫印迹检测BV2细胞内PBEF的量

3．5 RT-PCR检测PBEF的表达

3．6 PBEF在BV2细胞内的分布

3．7 细胞瞬时转染

3．8 ELISA检测TNF-α、IL-6、PBEF的释放

3．9 MTT检测细胞活性

4．0 统计方法

4．实验结果

第一部分 缺糖缺氧可诱导BV2细胞释放PBEF

第二部分 缺糖缺氧诱导BV2细胞释放PBEF的过程中伴有其他细胞因子的释放

第三部分 释放到细胞外的PBEF对BV2细胞本身活性的影响

5．讨论

参考文献

综述：烟酰胺磷酸核糖转移酶在炎症中的作用研究进展

作者简历及在读期间所发表的论文