富含半胱氨酸61在多发性骨髓瘤骨病中的作用及唑来膦酸抗骨髓瘤细胞机制研究

摘要

目的：构建多发性骨髓瘤骨病NOD/SCID小鼠模型,并探索富含半胱氨酸61（CCN1）在多发性骨髓瘤骨病（Myeloma bone disease，MBD）中的作用。研究唑来膦酸及其联合硼替佐米抗骨髓瘤细胞RPMI-8226的机制。
　　方法:第一部分多发性骨髓瘤骨病 NOD/SCID小鼠模型的构建。选取4-6周雌性 NOD/SCID小鼠，向小鼠右侧胫骨骨髓腔注射 RPMI-8226细胞悬液（5x106/ml）15μl，左侧注射相同体积PBS缓冲液15μl作为对照。按注射MM细胞后时间实验组分为3周组、5周组、7周组。每组实验动物为10只。分别通过X线及显微CT检测NOD/SCID小鼠骨质破坏情况；ELISA方法检测NOD/SCID小鼠外周血 RPMI-8226分泌λ轻链含量；免疫组织化学染色检测小鼠骨髓中细胞CD138表达情况；瑞氏染色检测NOD/SCID小鼠胫骨骨髓中MM细胞，骨髓瘤细胞抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）检测小鼠骨中破骨细胞情况。
　　第二部分在构建的多发性骨髓瘤骨病 NOD/SCID小鼠模型中探索富含半胱氨酸蛋白61(CRY61/CCN1)在多发性骨髓瘤骨病中的作用。通过慢病毒载体构建稳定上调富含半胱氨酸蛋白61(CRY61/CCN1)表达的RPMI-8226细胞，并采用以上建立的多发性骨髓瘤骨病 NOD/SCID小鼠模型构建方法，根据注射 MM细胞类型分为RPMI-8226组、RPMI-8226/EV组、RPMI-8226/CCN1组，每组实验动物为10只。注射细胞7周后通过显微 CT检测 NOD/SCID小鼠骨质破坏情况；ELISA方法检测NOD/SCID小鼠外周血RPMI-8226分泌λ轻链含量；免疫组织化学染色检测小鼠骨髓中 CD138表达情况；抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）检测小鼠胫骨中破骨细胞情况。ELISA方法检测MBD患者外周血中CCN1水平。研究对象为初治多发性骨髓瘤骨病患者25例，缓解组25例,以性别年龄相近的健康志愿者25名作为对照。
　　第三部分唑来膦酸及其联合硼替佐米抗骨髓瘤细胞 RPMI-8226机制研究。研究不同浓度唑来膦酸及其联合硼替佐米在24h及48h后对骨髓瘤细胞系RPMI-8226抑制作用及可能机制。采用CCK-8检测细胞增殖状况，流式细胞计数仪检测细胞凋亡，细胞免疫荧光染色检测 pim-2在 RPMI-8226细胞中的表达，实时定量PCR检测检测Pim-2、NF-κB在mRNA表达水平，蛋白免疫印迹（Western blot）检测Ras、AKT、pAKT以及NF-κB、Pim-2蛋白分子的表达。
　　结果:第一部分 X线检测NOD/SCID小鼠右侧胫骨注射多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226在3周、5周较两组中各自正常对照胫骨（L）并无明显差异；第7周可见右侧胫骨较左侧正常对照胫骨有明显胫骨损伤。显微CT检测发现，注射MM细胞后3周较正常对照胫骨未出现明显骨质破坏；注射MM细胞后5周与正常对照胫骨比较即可出现明显骨质破坏，注射MM细胞胫骨骨质较注射PBS胫骨骨质骨体积分数（Total bone volume/Total Volume）（0.365±0.063）VS（0.549±0.057）明显减低（P=0.022），注射MM细胞胫骨骨质较注射PBS胫骨骨质骨小梁体积（Trabecular bone volume）（1.104±0.077）VS（2.000±0.353）显著减低（P=0.043），注射MM细胞胫骨骨质较注射PBS胫骨骨质骨小梁分离度（Trabecular Spacing）（0.137±0.003）VS（0.102±0.025）无显著差别（P=0.072），但有增加趋势；注射MM细胞后7周与正常对照组比较出现了明显骨质破坏，注射MM细胞胫骨骨质较注射PBS胫骨骨质骨体积分数（Total bone volume/Total Volume）（0.322±0.061）VS（0.546±0.043）明显减低（P=0.006），注射MM细胞胫骨骨质较注射PBS胫骨骨质骨小梁体积（Trabecular bone volume）（0.719±0.125）VS（2.007±0.424）显著减低（P=0.007），注射MM细胞胫骨骨质较注射PBS胫骨骨质骨小梁分离度（Trabecular Spacing）（0.142±0.014）VS（0.096±0.014）显著增高（ P=0.008）。ELISA检测注射骨髓瘤细胞后3周血浆λ轻链含量轻链含量为（164.62±76.503） ng/ml，注射骨髓瘤细胞后5周血浆λ轻链含量为（611.93±131.484） ng/ml，注射骨髓瘤细胞后7周血浆λ轻链含量为（1308.91±251.584） ng/ml。各组差异均有有统计学意义（P＜0.05）。
　　免疫组织化学染色在3周、5周、7周组注射了MM细胞的NOD/SCID实验小鼠胫骨骨髓中CD138染色均出现阳性细胞染色。瑞氏染色发现NOD/SCID小鼠在注射MM细胞7周组中胫骨骨髓细胞中存在与细胞系RPMI-8826形态相同的骨髓瘤细胞。抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）发现注射MM细胞组中7周后出现了较正常对照组明显的（TRAP）染色结果。
　　第二部分慢病毒载体转染PRMI-8226细胞72h后，倒置荧光显微镜示慢病毒 eGFP绿色荧光在转染细胞中表达，台盼蓝染色检测 RPMI-8226/EV组和RPMI-8226/CCN1组细胞存活率为别为89.74％、88.43%，Western Blot检测转染慢病毒CYR61/CCN1载体能提高RPMI-8226细胞CCN1蛋白表达，转染空病毒RPMI-8226/EV组中 CCN1表达无明显增加。将慢病毒载体转染后的RPMI-8226/CCN1组和RPMI-8226/EV组以及未经转染的RPMI-8226细胞分3组分别注射到 NOD/SCID小鼠胫骨骨髓腔内，7周后，通过检测显微 CT示注射RPMI-8226细胞组及RPMI-8226/EV组均出现了明显的骨质破坏，RPMI-8226/CCN1组无明显的骨质破坏。注射 RPMI-8226/EV细胞组胫骨骨质较注射RPMI-8226/CCN1组胫骨骨质骨体积分数（Total bone volume/Total Volume）（0.276±0.103）VS（0.454±0.034）明显减低（P=0.047），注射RPMI-8226/EV细胞组胫骨骨质较注射 RPMI-8226/CCN1组胫骨骨小梁厚度（ Trabecular Thickness）（0.049±0.015） VS（0.078±0.004）明显减低（P=0.03），注射RPMI-8226/EV细胞组胫骨骨质较注射 RPMI-8226/CCN1组胫骨质骨小梁体积（ Trabecular bone volume）（0.648±0.298） VS（1.754±0.169）显著减低（P=0.005），注射 RPMI-8226/EV细胞组胫骨骨质较注射 RPMI-8226/CCN1组胫骨骨小梁分离度（Trabecular Spacing）（0.132±0.027）VS（0.092±0.008）无显著差别（P=0.068），但有增加趋势；ELISA法测初治MBD患者外周血上清液中 CCN1（282.58±119.46）pg/ml明显高于正常对照（202.12±41.53）pg/ml（P<0.05），缓解组（363.68±121.12）pg/ml较初治组亦明显升高（P<0.05）。ELISA检测注射骨髓瘤细胞7周后 RPMI-8226细胞组（n=10）λ轻链含量为（1308.91±251.584）ng/ml，RPMI-8226/CCN1细胞组（n=10）λ轻链含量为（569.54±146.513） ng/ml， RPMI-8226/EV细胞组（ n=10）λ轻链含量为（1230.53±251.363）ng/ml，RPMI-8226/CCN1细胞组较RPMI-8226/EV细胞组小鼠血浆Igλ显著降低（P=0.001）。免疫组织化学染色分别检测RPMI-8226细胞组、RPMI-8226/CCN1组和RPMI-8226/EV组NOD/SCID实验小鼠注射瘤细胞胫骨骨髓中 CD138染色均出现阳性细胞染色，抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）检测分别注射RPMI-8226细胞组及RPMI-8226/EV组NOD/SCID实验小鼠胫骨中出现了明显的TRAP染色阳性结果，而较RPMI-8226细胞组及RPMI-8226/EV组， RPMI-8226/CCN1组TRAP染色并未出现明显阳性结果。
　　第三部分CCK-8检测发现：单用唑来膦酸组中，唑来膦酸浓度分别为25μM,50μM,100μM,500μM,和1000μM，作用24h后细胞增殖抑制率分别为19.84±10.425,21.86±6.958,30.54±4.651,42.29±5.965,47.15±9.939。作用48h后细胞增殖抑制率分别为31.77±6.041,33.17±5.909,
　　34.60±4.716,41.21±5.427,45.03±3.500。唑来膦酸浓度为25μM,50μM时，对RPMI-8226细胞增殖抑制作用48h组明显高于24h组，而在唑来膦酸浓度分别为100μM,500μM,1000μM时对 RPMI-8226细胞增殖抑制作用48h组与24h组无显著差异。唑来膦酸联合硼替佐米的实验中，发现硼替佐米（10nM）联合唑来膦酸浓度在100μM,500μM,1000μM，作用24h时细胞增殖抑制率分别为47.24±9.316，44.37±7.124,49.87±11.797，与单用硼替佐米（10nM）组30.26±4.363比较有显著差异；但硼替佐米（10nM）联合唑来膦酸48h时与单用硼替佐米（10nM）组相比较无显著差异。联合组唑来膦酸浓度分别为100μM,500μM,1000μM时对RPMI-8226细胞增殖抑制作用48h组与24h组均无显著差异。
　　流式检测细胞凋亡实验中，药物作用24h后，唑来膦酸(250μM)较空白对照组显著增加(14.43±3.983)VS(1.83±0.503)（p=0.006），硼替佐米（B）10nM联合唑来膦酸125μM、250μM时细胞凋亡率31.07±3.675,49.00±13.952，与单用硼替佐米（B）10nM(19.50±2.68)相比有显著差异(p<0.05)。在48h组中，唑来膦酸（250μM）较空白对照组显著增加(35.33±7.059) VS(2.73±1.762)（p0.001），唑来膦酸125μM、250μM分别联合硼替佐米时较单药硼替佐米组对MM细胞凋亡作用无显著差异（p>0.05）。唑来膦酸联合硼替佐米作用24h时，唑来膦酸无论是低浓度（125μM）还是高浓度（250μM）联合组均显示出较单药硼替佐米更强的促进MM细胞凋亡的作用，而唑来膦酸联合硼替佐米作用48h时未显示出较单药硼替佐米更强的MM细胞凋亡作用。细胞免疫荧光实验示Pim-2在RPMI-8226细胞中表达，主要分布在细胞浆内。
　　实时定量PCR检测发现药物作用24h后NF-κB, Pim-2 mRNA水平在唑来膦酸250μM组中mRNA水平较空白对照组显著降低(p=0.0001, p=0.002)，在唑来膦酸125μM组中较空白对照组有降低趋势，但是差异无统计学意义(p=0.129, p=0.161)；AKT mRNA水平在硼替佐米及唑来膦酸组中均无明显差异；NF-κB, Pim-2在硼替佐米联合唑来膦酸125μM组中 mRNA水平较硼替佐米组显著降低(p=0.001, p=0.015)；在硼替佐米联合唑来膦酸250μM组中较硼替佐米组显著降低(p=0.0001, p=0.001)；AKT在硼替佐米及其联合唑来膦酸组中均未见明显差异。药物作用48h后信号通路分子AKT, NF-κB, Pim-2在硼替佐米分别联合唑来膦酸125uM、250 uM组中 mRNA水平较硼替佐米组差异无统计学差别（p＞0.05）。
　　蛋白免疫印迹（ Western blot）显示不同浓度 NF-Kb抑制剂（0μM,1μM,2.5μM,5μM,10μM）作用RPMI-8226细胞48h后，伴随着NF-κB减低, Pim-2分子表达也被抑制。唑来膦酸250μM组较空白对照组显著降低Ras、pAKT以及NF-κB, Pim-2蛋白水平。唑来膦酸125μM组较空白对照组未显著降低Ras、pAKT以及NF-κB, Pim-2蛋白水平。硼替佐米联（10nM）合唑来膦酸（125μM、250μM）（24h）组均能显著降低Ras、pAKT以及NF-κB, Pim-2蛋白表达水平。硼替佐米联合唑来膦酸（125μM、250μM）（48h）组未能显著降低 Ras、pAKT、NF-Kb、pim-2分子。
　　结论:通过注射RPMI-8226细胞到NOD/SCID小鼠胫骨骨髓腔内能成功构建用于多发性骨髓瘤骨病相关研究的骨病小鼠模型；注射MM细胞后7周能通过X线方法检测到骨质破坏，在注射MM细胞后5周时通过显微CT能检测到的骨质破坏。故模型用于研究早期骨质破坏相关研究；其骨质破坏机制可能是注射的MM细胞导致NOD/SCID小鼠骨组织中破骨细胞数量增多及功能增强有关。CCN1在MBD初治组、缓解组患者中较正常人升高。多发性骨髓瘤骨病NOD/SCID小鼠模型中证实CCN1能在小鼠体内降低MM瘤负荷，抑制MM骨质破坏。唑来膦酸（250μM）及唑来磷酸(125μM，250μM)联合硼替佐米(10nM)可通过NF-κB/Pim-2细胞细胞信号通路抑制MM细胞增殖。同时，Ras及 pAkt分子也受到抑制。唑来磷酸(125μM，250μM)联合硼替佐米(10nM)在24h组而不是48h组显示出明显的抗瘤作用，故据此推测唑来磷酸与硼替佐米在24h联合使用降低MM患者瘤负荷发挥重要协同作用。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、 多发性骨髓瘤骨病NOD/SCID小鼠模型构建

1.1 主要试剂、仪器

1.2实验方法

1.3结果

1.4 讨论

1.5 小结

二、富含半胱氨酸蛋白61(CRY61/CCN1)对多发性骨髓瘤骨病作用的研究

2.1 主要试剂、仪器及研究对象

2.2实验方法

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 小结

三、唑来膦酸抗多发性骨髓瘤细胞机制研究

3.1 主要试剂、仪器

3.2实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

3.5 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述: 骨髓微环境中细胞因子影响骨髓瘤骨病的研究进展

致谢

个人简历