毒莠定(PIC)调控百子莲愈伤组织胚性诱导与保持生理生化基础的研究

摘要

外源生长素类物质毒莠定（PIC）能够有效地诱导百子莲（Agapanthus praecox ssp. orientalis）外植体形成非胚性愈伤组织（No Embryogenic Culture，NEC）并发育成胚性愈伤组织（Embryogenic callus，EC），且在含有不同浓度PIC的培养基上继代培养的EC具有不同的胚性保持能力。本文选取了‘蓝色大花’百子莲体细胞胚胎发生过程中NEC、1.0 mg/L、1.5mg/L和2.0 mg/L PIC继代的EC共4种样品对其细胞形态学观察，并进行内源生长素（IAA）含量、物质能量代谢规律、氧化胁迫与抗氧化系统、细胞程序性死亡（Programmed cell death，PCD）、DNA甲基化水平等生理生化指标的分析研究，利用 qRT-PCR技术对分离与鉴定的激素信号、细胞分裂与细胞周期过程、抗氧化系统等46个关键基因进行定量分析，并对生理生化结果进行验证，旨在研究PIC对百子莲体细胞胚性诱导与保持的生理生化基础，主要研究结果如下：
　　（1）形态学观察结果表明NEC细胞体积大而核小，细胞内淀粉含量丰富；EC呈现为黄色颗粒状或部分细胞已经成胚。NEC的内源IAA含量最低，为0.177 ng/g.FW；随着外源PIC浓度的升高，EC中内源IAA含量逐渐下降，且显著高于NEC，分别为NEC的14.2、10.5与4.0倍，表明外源生长素与內源IAA信号之间存在竞争关系。高含量的淀粉、可溶性蛋白分别在体细胞分化、胚性的启动与保持上起重要作用。百子莲NEC与EC中共检测到10种脂肪酸，其中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸各5种；1.5mg/L PIC浓度下EC中油酸，硬脂酸，山嵛酸与木蜡酸的百分含量分别为显著高于NEC，而表征脂肪酸双键指数（Double-bind index，DBI）明显低于NEC，意味着胚性能力的保持需要的脂肪酸含量高且脂肪酸双键指数低。
　　（2）3种抗氧化酶SOD、POD和CAT和ROS组分（O2·-、OH·和H2O2）在百子莲胚性能力获得和维持中相互制约，维持细胞内活性氧的平衡，进而促进体细胞胚性的获得及保持。O2·-、OH·和H2O2的积累和扩散启动PCD，清除多余的胚柄（supensor organism）、建立胚胎极性，启动体胚发生。
　　（3）采用MSAP（Methylation Sensitive Amplified Polymorphism）技术对百子莲NEC、3个浓度PIC继代的EC进行DNA甲基化水平研究发现，在NEC转化为EC的过程中总甲基化率降低了约2个百分点，而随着外源PIC浓度的升高或降低，EC中碱基序列的变化比更为频繁，总甲基化率升高了6-14个百分点，DNA甲基化率维持在26％以下是体胚发生过程中必不可少的，调控 EC有更多的基因处于活跃的转录状态，从而维持其胚性能力。
　　（4）利用qRT-PCR对百子莲NEC与不同浓度PIC（1.0，1.5，2.0 mg/L）继代的EC进行激素信号、细胞分裂与细胞周期过程、抗氧化系统等46个关键基因的表达定量分析，结果表明生长素信号与乙烯信号增强，染色质结构与表观遗传修饰调控作用明显增强，细胞壁结构与附属结构发生重要的变化，物质能量代谢、次生代谢及能量运输过程减弱。在体细胞胚性保持过程中糖组分、激素信号、细胞分裂与细胞周期过程及表观遗传方面存在较大差异，这与前面的淀粉粒观察和脂肪酸定量分析的结果是一致的。

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缩略词

第一章 前 言

1.1文献综述

1.2 植物体胚发生技术研究现状及问题分析

1.3 研究目的与意义

1.4 研究内容与实验设计思路

第二章 百子莲胚性及非胚性愈伤组织细胞学与生理学研究

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

2.4 小结

第三章 DNA甲基化对百子莲NEC胚性获得与保持的调控

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

3.4 小结

第四章 百子莲NEC胚性获得和维持的关键基因表达分析

4.1 材料与方法

4.2结果与分析

4.3 讨论

4.4 小结

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

致谢

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