百子莲胚性愈伤组织玻璃化法超低温保存技术的研究

摘要

本研究以百子莲胚性愈伤组织为试验材料，通过试验得出以下结论:
　　(1)建立了百子莲胚性愈伤组织的玻璃化法超低温保存体系。取继代培养20 d后的百子莲胚性愈伤组织50±10 mg，在4℃低温条件下、0.5 mol/L蔗糖的MS培养基上预培养2d，然后在室温下将250±10 mg胚性愈伤组织放入含2mL装载液的冷冻管中处理60min，去除装载液后，在0℃条件下放入2 mL玻璃化溶液(PVS2)处理40 min，快速投入液氮1h后，于40℃水浴中解冻90 s，快速吸除PVS2溶液后，用去装载液洗涤3次，每次间隔10 min，置于恢复培养基上24 h后，测定细胞成活率(TTC)达56.9％，胚性愈伤组织能够正常增殖。
　　(2)利用AFLP分子标记技术对恢复培养55 d后的百子莲胚性愈伤组织遗传稳定性进行评价。采用8个正向引物和8个反向引物组合成64对组合，对随机选取的供试样品进行了AFLP分析，结果表明经6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测后，共分离得到3086个条带，其中有6个差异条带，变异率低于1％。
　　(3)研究了百子莲胚性愈伤组织玻璃化法超低温保存过程中含水量、相对电导率、丙二醛质量摩尔浓度、可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白质量分数的变化规律，并对各生理指标之间以及生理指标与细胞成活率之间的相关性进行了分析。结果表明:在投入液氮冷冻前，含水量显著降低到41.5％，恢复培养24 h后，含水量迅速回升;相对电导率与丙二醛的变化规律相一致，均从预培养到快速解冻过程中持续上升，至恢复培养24h后缓慢下降;可溶性糖含量呈双峰曲线变化;淀粉和可溶性蛋白含量的变化趋势相似，均呈先下降，后上升，再下降的变化。多元相关分析表明:相对电导率与丙二醛呈显著正相关;细胞存活率与相对电导率呈极显著负相关，与丙二醛呈显著负相关，相关系数分别为-0.999和-0.896。说明在百子莲胚性愈伤组织玻璃化法超低温保存过程中，膜质伤害对细胞成活率的影响最大。
　　(4)添加外源抗氧化剂对提高细胞成活率至关重要。与不添加的对照相比，褪黑素、脱落酸、谷胱甘肽均显著地提高细胞成活率，分别提高到74.7％、71.6％和59.2％，表明在百子莲胚性愈伤组织玻璃化法超低温保存中，氧化胁迫是导致细胞膜质伤害最主要的原因。

目录

摘要

1 绪论

1．1 植物种质资源超低温保存技术的研究概况

1．1．1 脱水法

1．1．2 微滴法

1．1．3 包埋法和包埋脱水法

1．1．4 玻璃化法、微滴玻璃化法和包埋玻璃化法

1．2 玻璃化法超低温保存技术的研究进展

1．2．1 影响玻璃化法超低温保存技术的关键步骤

1．2．2 超低温保存后材料活性的检测

1．3 植物种质资源超低温保存的遗传稳定性

1．3．1 形态标记

1．3．2 细胞标记

1．3．3 生化标记

1．3．4 分子标记

1．4 超低温保存中生理生化的基础

1．4．1 含水量

1．4．2 可溶性糖和可溶性蛋白

1．4．3 淀粉

1．4．4 丙二醛与相对电导率

1．5 百子莲属植物种质资源概况

1．5．1 种类与地理分布

1．5．2 离体繁殖与种质资源保存

1．6 本试验研究的目的、意义及技术路线

1．6．1 本试验研究的目的及意义

1．6．2 技术路线

2 百子莲玻璃化法超低温保存体系的建立

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 方法

2．2 结果与分析

2．2．1 蔗糖浓度对细胞存活率的影响

2．2．2 预培养时间对细胞存活率的影响

2．2．3 装载时间对细胞存活率的影响

2．2．4 脱水时间对细胞存活率的影响

2．2．5 正交试验设计

2．3 本章小结

3 百子莲胚性愈伤组织超低温保存后的遗传稳定性评价

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 结果与分析

3．2．1 DNA提取的质量检测

3．2．2 DNA酶切与连接

3．2．3 预扩增

3．2．4 选择性扩增

3．2．5 AFLP分子标记检测基因组稳定性

3．3 本章小结

4 超低温保存中生理生化变化

4．1 试验材料与方法

4．1．1 含水量的测定

4．1．2 丙二醛质量摩尔浓度和相对电导率的测定

4．1．3 可溶性糖和可溶性蛋白质量分数的测定

4．1．4 淀粉质量分数的测定

4．1．5 数据分析

4．2 试验结果与分析

4．2．1 细胞内含水量的变化

4．2．2 丙二醛质量摩尔浓度的变化

4．2．3 相对电导率的变化

4．2．4 可溶性糖质量分数的变化

4．2．5 可溶性蛋白质量分数的变化

4．2．6 淀粉质量分数的变化

4．2．7 各生理指标之间与玻璃化法超低温保存细胞存活率之间多元相关分析

4．3 本章小结

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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