游离脂肪酸在代谢综合症中的作用及干预研究

摘要

背景代谢综合征(MS)是指伴有中心性肥胖、糖尿病或糖耐量异常、高血压、高血脂等代谢方面异常的一组疾病总称,其发生心脑血管及外周血管并发症的风险明显增加,然而其中的分子机制并不十分清楚。目前已知血管内皮功能异常和动脉粥样硬化(AS)是这些并发症的共同特征。有研究显示氧化应激在其中起重要作用。MS和糖尿病患者异常增高的血游离脂肪酸和血糖导致活性氧簇(ROS)和活性氮簇(RNS)生成增多,从而启动了氧化应激机制,也激活应激敏感信号通路,这些信号通路不仅与胰岛素抵抗和β细胞功能受损密切相关,加重了糖尿病持续进展与恶化,而且直接促进了代谢综合症心血管并发症的发生发展。深入探讨游离脂肪酸引起氧化应激的机制及相应干预机制,对今后有效防治代谢综合征心血管并发症的发生发展具有极其重要的作用。减轻ROS的产生增加体内抗氧化应激系统的活性成为减轻糖尿病血管并发症的重要干预措施。硫氧还蛋白系统是重要的内源性抗氧化系统,在维持细胞内氧化还原平衡稳态过程中发挥至关重要的作用。其活性降低是糖尿病血管氧化应激活化的重要机制。因此,增加硫氧还蛋白的表达及提高其活性就对代谢综合征血管并发症具有治疗作用。研究发现,独立于其降糖作用之外,二甲双胍尚有直接的血管保护作用。二甲双胍能够减轻细胞内活化氧簇。然而,对于二甲双胍的抗氧化作用的具体分子机制目前还尚不完全清楚,有研究显示其可能通过硫氧还蛋白发挥作用。本研究中,我们将观察二甲双胍是否能减轻棕榈酸诱导的细胞内氧化应激水平并探讨其可能涉及的细胞内分子机制。从而为代谢综合征心血管并发症的干预治疗提供理论依据。材料与方法细胞培养原代人主动脉内皮细胞株,复苏后置于37℃培养箱内进行培养传代,细胞培养采用内皮细胞生长培养基(EGM-2,Cambrex公司,美国)。取生长良好的传代细胞进行相应处理。利用Trx, AMPK或FOXO3的小干扰RNAs进行转染,或者给予细胞不同浓度的二甲双胍或棕榈酸等干预处理。基因沉默利用Trx, AMPK和FOXO3的siRNA分别沉默相应的基因表达。室温下根据产品操作手册对siRNA或质粒DNA用lipofectamine 2000进行脂质体包裹。细胞经孵育转染后,跟据设计的浓度梯度给予棕榈酸和二甲双胍处理。细胞内ROS水平测定我们利用活性氧荧光探针CM-H2DCFDA检测细胞内ROS水平。以荧光强度代表了细胞内ROS水平的高低。处理组的ROS水平与对照组比较,并以对照组的比分数来表示相对水平。Western Blot提取处理细胞总蛋白。采用Bradford法测定蛋白浓度。蛋白上样至SDS-PAGE,80V电泳,后转移至聚偏氟乙烯膜(PVDF)上,PVDF膜使用封闭液封闭,加入一抗中4。C孵育过夜,清洗后,给予HRP标记二抗。ECL曝光显色。利用Quantity One imaging软件(Bio-Rad)定量蛋白条带的密度。相应的蛋白水平经β-actin校正后,以对照组水平的百分比表示。实时定量-PCR根据说明手册,利用Trizol试剂盒提取总RNA。利用Bio-Rad的iScript cDNA synthesis试剂盒进行mRNA的反转录,采用目的基因与β-actin的循环阈值(threshold cycle, Ct)并通过公式2ΔCt (ΔCt=β-actinCt-target gene Ct)计算目的mRNA的水平。结果1.二甲双胍减轻内皮细胞内棕榈酸诱导的活性氧簇(ROS)的产生检测二甲双胍与棕榈酸孵育的HAEC细胞内ROS含量。试验结果显示,棕榈酸能显著升高细胞内源性ROS的水平,二甲双胍能够以剂量依赖性的方式减轻这种棕榈酸诱导的内源性ROS的产生。提示二甲双胍具有减轻细胞内ROS水平的能力。2硫氧还蛋白介导二甲双胍对ROS水平的抑制调节二甲双胍单独作用可轻度升高硫氧还蛋白的表达,而在棕榈酸存在的情况下,二甲双胍能明显的升高硫氧还蛋白的表达,且该作用呈剂量依赖性。同时,二甲双胍促进硫氧还蛋白mRNA的产生,提示二甲双胍对硫氧还蛋白的调节作用在基因转录水平。硫氧还蛋白经siRNA处理表达沉默后,能够阻断二甲双胍对ROS水平的抑制作用,不管有没有棕榈酸的存在。该结果提示在基础及棕榈酸干预状态下,二甲双胍对ROS的影响都是通过硫氧还蛋白起作用。3二甲双胍通过AMPK通路的活化上调硫氧还蛋白的表达二甲双胍以剂量依赖性方式促进AMPK的磷酸化,二甲双胍可以活化AMPK通路。运用特异的小干扰RNA将AMPK敲掉后,不管是在基础状态下,还是在二甲双胍干预状态下,硫氧还蛋白的表达都被抑制了,二甲双胍通过AMPK通路可在基因转录水平调节硫氧还蛋白的表达。4转录因子FOXO3参与二甲双胍诱导的硫氧还蛋白的表达上调利用特异性小干扰RNA沉默FOXO3的表达后,基础和二甲双胍干预状态下的硫氧还蛋白的蛋白表达和基因mMRA的表达都被抑制了,提示转录因子FOX03参与了二甲双胍对硫氧还蛋白的上调作用。结论l高游离脂肪酸可以诱导内皮细胞ROS产生增多,出现氧化应激状态,二甲双胍干预可以抑制该过程。2二甲双胍通过增加抗氧化因子硫氧还蛋白的表达抑制游离脂肪酸诱导的内皮细胞内ROS水平的升高。3二甲双胍对硫氧还蛋白的调节作用是通过激活AMPK-FOXO3信号通路进行的。背景肥胖已成为我国面临的一个严重的公共健康问题。既往大量的研究证实肥胖特别是腹型肥胖与糖尿病,高血压及冠心病等慢性疾病关系密切,在国际糖尿病联盟(IDF)新的代谢综合征诊断标准中腹型肥胖也被确认为首要的危险因素。腹型肥胖主要表现为脂肪的异常分布,特别是内脏脂肪的异常沉积。脂肪酸转化为甘油三酯在细胞内沉积是人类最主要的能量储存,也是行使细胞功能的脂类的主要来源。不同的人储存脂肪的方式不同,从而经过长期的能量正平衡形成不同类型的肥胖。以前的研究显示女性最容易皮下和身体下部积聚脂肪,而男性倾向于在内脏(大网膜与肠系膜)储存脂肪。二脂酰甘油酰基转移酶(DGAT)催化甘油三酯(TG)合成的最后步骤,被认为是TG合成通路的调节与限速酶。我们假设这种脂肪分布的不同是由于在不同脂肪组织中DGAT的活性不同造成。若此成立,大网膜与皮下脂肪细胞中DGAT活性的不同可以解释男女性的脂肪储存的差异。对人类不同部位脂肪组织DGAT活性活性的了解有助于进一步探索人体甘油三酯代谢的调节和脂质的分布机理。材料与方法在研究中,我们使用脂肪细胞的细胞质或微粒体比较了两种测定DGAT活性的不同方法。之后我们检测了男性与女性的不同部位脂肪组织DGAT活性及其对脂肪代谢等因素的影响。我们收集了进行选择性手术的7位非肥胖的女性、5位非肥胖的男性(BMI<；30 kg/m2),14位肥胖的女性、9位肥胖的男性(BMI>；30 kg/m2)的大网膜与腹部脂肪组织样本。游离脂肪酸摄取与脂肪细胞的大小在取得标本后立即测定。通过测定细胞将[14C]棕榈酰辅酶A转化为甘油三酯的量测量DGAT的活性,结果以nmol/分钟/毫克脂肪表示。手术前一天测量腹围和大腿围评估脂肪分布。使用临床计算机断层扫描(CT)的影像,计算了受试者内脏脂肪量和腹部皮下量。结果非肥胖患者大网膜脂肪组织的DGAT活性显著高于腹部皮下脂肪组织,而肥胖者的大网膜和腹部皮下脂肪的DGAT活性没有统计学差异。男女之间,无论是网膜还是皮下脂肪的DGAT活性均无统计学差异。所有受试者的网膜脂肪组织中游离脂肪酸(FFA)的摄取与DGAT活性之间存在着显著的相关性。非肥胖女性与肥胖男性的细胞直径存在统计学差异。肥胖与非肥胖患者的DGAT的活性与皮下脂肪细胞的大小存在显著差异。结论我们的研究结果表明,DGAT的活性差异与重量有关。男性与女性之间的DGAT活性没有差异。因此,男女脂肪积聚的不同不太可能是由于DGAT活性不同造成。人类的DGAT活性在脂肪代谢中的作用尚需进一步的研究。

目录

中文摘要Ⅰ

英文摘要Ⅰ

符号说明Ⅰ

论文Ⅰ

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

中文摘要Ⅱ

英文摘要Ⅱ

符号说明Ⅱ

论文Ⅱ

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

致谢

攻读博士学位期间的学术成果

学位论文评阅及答辩情况表

SCI论文Ⅰ

References

SCI论文Ⅱ

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