自组装IKVAV纳米纤维对APP/PS1双转基因小鼠的作用及可能的机制的研究

摘要

研究背景与研究目的
　　阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)是引起老年人痴呆最常见的一种中枢神经系统变性疾病。典型的临床表现为进行性和不可逆的记忆力和认知功能减退。细胞外β淀粉样蛋白沉积(Aβ)、细胞内Tau蛋白过度磷酸化形成的神经元纤维缠结(neurofibrillarytangles，NFTs)以及局部神经元和突触丢失构成了AD典型的临床病理表现。然而到目前为止对于AD仍无有效的治疗方法。
　　目前，关于AD的病因学还没有确定，但是大多数学者认为细胞外Aβ沉积引起神经元丢失和细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)完整性被破坏等一系列病理生理变化的级联反应，是引起AD的关键原因。大量研究证实，在动物以及成年人的脑室下区(subventricularzone，SVZ)以及海马齿状回(dentategyrus，DG)的颗粒下层(subgranularlayer,SGL)存在着大量的神经干细胞(neuralstemcells，NSCs)，内源性神经生成存在于动物和成年人的一生，但是研究发现，在AD的患者或者AD的转基因动物模型内（APP/PS1小鼠），由于脑内微环境的破坏而使脑内的神经干细胞的增殖以及成熟受到阻碍或者破坏。大量动物研究证实促进体内神经干细胞增殖或者成熟，或者移植神经干细胞替代丢失的神经元，可以改善AD动物模型的认知以及延缓AD动物脑内的病理指标。但是在AD动物模型中移植神经干细胞存在细胞分化率低，大部分细胞为神经胶质细胞。因此，寻找一更安全以及有效地促进内源性神经生成和改善ECM的完整性的化合物来预防AD的发生及发展或者治疗AD是目前比较紧急的任务。
　　异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸(IKVAV)是来自于来自层粘连蛋白具有神经活性的五肽，带有IKVAV的两亲性分子(IKVAV-PA)能够在体内生理条件下，自发的发生组装形成ECM样的结构，替代体内丢失的或者破坏的ECM结构;并且可以自发地形成三维圆柱样纳米纤维，使IKVAV的表型密度增加1000倍。研究发现，在体外，IKVAV-PA也能够自发形成三维圆柱样纳米纤维，促进NSCs增殖以及快速向神经元方向的分化和成熟，增加神经元的分化率。最近研究证实，脊髓内注射IKVAV-PA能够通过抑制胶质疤痕的形成以及促进轴突的延长，促进脊髓损伤动物的神经功能恢复，除此之外该研究还进一步证实体内注射IKVAV-PA两周后会被代谢为单个氨基酸，为体内细胞提供生长代谢的营养物质。那么IKVAV-PA体内注射到AD的动物模型中能否对AD动物模型的认知功能以及病理生理过程产生影响，能否改善体内丢失或者被破坏的ECM结构，以及能否促进体内神经干细胞的增殖与分化。
　　因此，根据以上的研究基础，我们利用6月龄雄性APP/PS1双转基因小鼠作为AD的动物模型，通过立体定向注射IKVAV-PA到APP/PS1双转基因小鼠的双侧海马中，分别观察注射2周后以及4周后，IKVAV-PA对APP/PS1双转基因小鼠的认知功能和病理生理的作用以及可能的机制。
　　研究方法
　　1.6月龄雄性APP/PS1小鼠作为AD的实验模型，随机分为两组，一组双侧海马立体定向注射4μl1％IKVAV-PA作为实验组，另一组为双侧海马立体定向注射4μl的生理盐水(NS)作为对照组，同月龄的雄性C57BL/6小鼠（野生型小鼠，WT）作为额外的阴性对照组，双侧海马立体定向注射4μl的NS。
　　2.分别于立体定向注射后1周以及3周后行MORRIS水迷宫(MWM)测试，检测APP/PS1双转基因小鼠的空间学习和空间记忆能力。
　　3.于MWM检测之后，通过ELISA检测APP/PS1双转基因小鼠皮质和海马内可溶性Aβ1-42以及Aβ1-40的含量;通过硫磺素硫染色检测APP/PS1双转基因小鼠皮质和海马内老年斑的含量;通过免疫荧光染色单标Brdu以及Brdu和DCX双标检测APP/PS1双转基因小鼠海马齿状回内神经干细胞的增殖和神经元的分化;通过免疫组化染色标记Aβ1-42在APP/PS1双转基因小鼠皮质和海马内的表达量;通过WesternBlot检测蛋白p-Tau、APP、ERK1/2以及p-ERK1/2在APP/PS1双转基因小鼠的皮质和海马内的表达量;通过实时定量PCR检测IDE、NEP以及BACE1在APP/PS1双转基因小鼠的皮质和海马内的基因表达量。
　　研究结果
　　1.立体定向注射IKVAV-PA4周对APP/PS1双转基因小鼠的认知功能和病理生理指标的改善以及可能的作用机制。
　　1.1IKVAV-PA能够明显改善APP/PS1双转基因小鼠在MWM的表现。
　　与接受NS注射的APP/PS1双转基因小鼠相比，在定位航行实验的最后3天，IKVAV-PA明显地降低APP/PS1双转基因小鼠寻找隐蔽平台所需的路径以及时间（逃避潜伏期），但是仍然高于同龄组接受NS注射的野生型小鼠，两组之间没有统计学意义。并且我们还发现，与接受NS注射的APP/PS1双转基因小鼠相比，在空间学习的过程中，接受IKVAV-PA治疗的APP/PS1双转基因小鼠和接受同等剂量NS的野生型小鼠与其他三个非靶象限相比，有明显的靶象限偏好，而接受NS注射的APP/PS1双转基因小鼠没有靶象限偏好。在空间探索实验中，我们发现，与接收同等剂量NS注射的APP/PS1双转基因小鼠相比，接受IKVA-PA注射的APP/PS1双转基因小鼠以及接受同等剂量NS的野生型小鼠在探索实验中穿越平台的次数和在平台所在象限的时间明显增加;接受IKVAV-PA注射的APP/PS1双转基因小鼠在探索实验中穿越平台的次数和在平台所在象限的时间仍然低于同龄组的野生型小鼠，但是两组之间无统计学意义。除此之外，我们还发现三组之间的游泳速度没有明显的区别。
　　1.2IKVAV-PA明显增加APP/PS1双转基因小鼠海马齿状回区域内源性神经干细胞的增生和神经元分化。
　　免疫荧光结果显示:与接受同等剂量的NS的APP/PS1双转基因小鼠相比，在接受IKVAV-PA注射的APP/PS1双转基因小鼠的海马齿状回中，Brdu标记的细胞、DCX标记的细胞以及Brdu和DCX双标的细胞数目明显增多，除此之外我们还发现在接受IKVAV-PA注射的APP/PS1双转基因小鼠的海马齿状回中，DCX标记阳性的细胞排列较整齐。
　　1.3IKVAV-PA能够降低APP/PS1双转基因小鼠脑内老年斑和可溶性Aβ1-42和Aβ1-40的含量。
　　硫代硫染色结果提示:IKVAV-PA明显降低APP/PS1双转基因小鼠海马和皮质区域内老年斑的面积。从ELISA结果分析我们可以得到:IKVAV-PA能够明显降低APP/PS1双转基因小鼠海马和皮质区域内可溶性Aβ1-42和Aβ1-40的含量。
　　1.4IKVAV-PA明显激活了APP/PS1小鼠海马和皮质区域内ERK1/2的信号通路。
　　WesternBlot显示IKVAV-PA明显增加了APP/PS1双转基因小鼠海马和皮质区域内p-ERK1/2的表达含量，但是对总的ERK1/2表达无影响。
　　2.立体定向注射IKVAV-PA2周后对APP/PS1双转基因小鼠的认知功能以及其病理生理的改善以及可能的作用机制。
　　2.1IKVAV-PA能够明显改善APP/PS1小鼠在MWM的表现。
　　与对照组相比，IKVAV-PA明显地降低APP/PS1小鼠在定位航行实验的第5天寻找隐蔽平台所需的路径以及时间（逃避潜伏期），但是仍然高于同龄组的野生型小鼠，两组之间没有统计学意义;与接受同等剂量NS注射的APP/PS1双转基因小鼠相比，接受IKVA-PA注射的APP/PS1双转基因小鼠以及接受同等剂量的NS的野生型小鼠在探索实验中穿越平台的次数和在隐蔽平台所在象限的时间明显增加;接受IKVAV-PA注射的APP/PS1双转基因小鼠在探索实验中穿越平台的次数和在平台所在象限的时间仍然低于同龄组的野生型小鼠，但是两组之间无统计学意义。除此之外，我们还发现三组之间的游泳速度没有明显的区别。
　　2.2IKVAV-PA能够改善APP/PS1双转基因小鼠脑内的一些病理指标。
　　硫代硫染色显示:IKVAV-PA能够明显降低APP/PS1双转基因小鼠海马中老年斑的含量，但是对皮质中老年斑的含量无明显影响。Aβ1-42免疫组化染色显示:IKVAV-PA能够明显降低APP/PS1双转基因小鼠海马内总的Aβ1-42的表达，但是对皮质内总的Aβ1-42的表达没有影响，ELISA结果显示IKVAV-PA能够明显降低APP/PS1双转基因小鼠皮质和海马组织中可溶性Aβ1-42和Aβ1-40的含量。
　　2.3IKVAV-PA能够改变APP/PS1双转基因小鼠脑内的APP的剪切过程。
　　WesternBlot和realtimePCR结果显示:IKVAV-PA对APP/PS1双转基因小鼠皮质和海马中APP的产出无影响，但是IKVAV-PA能够明显抑制APP/PS1双转基因小鼠皮质和海马中的BACE1的表达抑制淀粉样蛋白的生成;明显增加APP/PS1双转基因小鼠皮质和海马中IDE和NEP的表达，促进淀粉样蛋白的体内降解。除此之外，我们还发现IKVAV-PA对APP/PS1双转基因小鼠皮质和海马中p-Tau的含量无影响。
　　结论
　　1.IKVAV-PA注射4周后可能是通过激活APP/PS1双转基因小鼠海马和皮质内p-ERK1/2的表达，促进海马齿状回内源性神经干细胞的增殖和神经元的分化，明显缓解了APP/PS1小鼠的认知功能的损害以及皮质和海马内老年斑以及可溶性Aβ1-42和Aβ1-40的含量。
　　2.IKVAV-PA注射2周后能够明显改善APP/PS1双转基因小鼠损害的学习和记忆能力，以及降低双转基因小鼠海马内老年斑以及海马和皮质内可溶性Aβ1-42和Aβ1-40的含量，这些变化可能与IKVAV-PA抑制海马和皮质内BACE1的表达以及增加海马和皮质内IDE、NEP的表达，改变了APP的剪切过程，抑制Aβ生成，增加了Aβ体内降解有关。
　　3.IKVAV-PA作为一种可溶性生物材料，很有希望成为治疗AD的新方向。