促甲状腺激素通过甘油磷酸酰基转移酶3调节甘油三酯合成

摘要

目的:
　　1、确定促甲状腺激素调节脂肪组织甘油三酯含量，利用亚临床甲状腺功能减退的小鼠模型及TSH刺激的成熟3T3-L1脂肪细胞研究TSH对脂肪细胞甘油三酯合成的作用。
　　2、通过TSH受体敲除的小鼠体内脂质代谢相关酶的mRNA变化，筛选出TSH可能的作用靶点。
　　3、通过TSH刺激成熟3T3-L1脂肪细胞，检测GPAT3、PPARγ、p-AMPK、t-AMPK的蛋白、mRNA水平，探讨TSH引起脂质合成增加的可能机制。
　　4、通过TSH受体敲除的小鼠模型，检测GPAT3、PPARγ、p-AMPK、t-AMPK的蛋白、mRNA水平，进一步探讨TSH引起脂质合成增加的可能机制。
　　5、利用PPARγ、AMPK特异性阻断剂或TSHR、PPARγ、GPAT3特异性小干扰RNA（SmallⅠnterfering RNA，siRNA）或转染持续激活或抑制性AMPK质粒处理细胞，检测GPAT3、PPARγ、p-AMPK、t-AMPK的表达，探讨TSHR、AMPK、PPARγ、GPAT3在TSH所引起的脂质沉积中所起的作用。
　　方法:
　　1、细胞培养:1）3T3-L1细胞根据美国模式菌种收集中心(ATCC)细胞培养标准使用高糖DMEM培养液中培养、诱导分化。2）人脂肪原代细胞、小鼠脂肪原代细胞人或小鼠脂肪组织剪碎，使用Ⅰ型胶原酶在37℃孵箱中消化30-40 min，过筛去掉未消化的组织，PBS冲洗细胞，并接种在新的培养皿中，使用含新生牛血清的DMEM/F12培养基培养。
　　2、动物模型:通过小剂量他巴唑喂养建立亚临床甲状腺功能减退小鼠模型，并在Jackson实验室购买TSHR敲除小鼠模型。
　　3、采用RT-PCR检测GPAT3、PPARγ mRNA的表达。
　　4、采用Western Blotting检测GPAT3、PPARγ、p-AMPK、t-AMPK及beta-actin蛋白水平变化。
　　5、采用免疫荧光方法检测GPAT3、PPARγ在脂肪组织及细胞中的表达，H&E染色了解组织结构。
　　6、GPAT3、PPARγ及TSHR基因沉默:以GPAT3、PPARγ及TSHR特异性siRNA转染成熟3T3-L1脂肪细胞以沉默GPAT3、PPARγ及TSHR表达。
　　7、AMPK持续激活或抑制:以CA-AMPK或DN-AMPK质粒转染成熟3T3-L1脂肪细胞以持续激活或抑制AMPK表达。
　　8、GPAT3、PPARγ活性检测:采用荧光素酶报告基因的方法检测GPAT3、PPARγ的活性。
　　9、采用酶联免疫分析检测小鼠体内adiponectin的水平变化。
　　结果:
　　1、促甲状腺激素调节脂肪组织甘油三酯含量:亚临床甲状腺功能减退的小鼠表现为体重增加，总脂肪重量增加，有较高的BMI水平及附睾脂肪指数。进一步处死小鼠后分别观察了两组小鼠的附睾、肾周白色脂肪组织的外观及脂肪细胞的体积大小（H&E染色），发现亚临床甲状腺功能减退的小鼠附睾、肾周白色脂肪组织含量较对照组小鼠显著增加，脂肪细胞体积增大。通过体外实验证实，促甲状腺激素刺激显著增加成熟的3T3-L1脂肪细胞内的脂滴数量。与之一致的，3T3-L1脂肪细胞内的甘油三酯含量在TSH的刺激下呈时间、剂量依赖性的增加。
　　2、TSH调节甘油三酯合成是通过GPAT3:体内实验发现，TSHR敲除的小鼠体内GPAT3 mRNA及蛋白表达均显著下降。体外研究发现TSH能刺激GPAT3的蛋白表达及其在胞浆的聚集并增加GPAT3的活性。利用GPAT3 siRNA干扰掉GPAT3后，TSH介导的甘油三酯合成被阻断。
　　3、PPARγ在促甲状腺激素介导的脂质生成中是必不可少的:体内研究发现，TSHR敲除的小鼠PPARγ mRNA水平较对照组小鼠水平下降。Western blotting检测发现TSHR敲除的小鼠PPARγ蛋白较对照组小鼠表达水平下降。体外研究显示，在成熟的3T3-L1脂肪细胞中，利用免疫荧光的方法检测PPARγ的蛋白表达，发现TSH刺激的细胞PPARγ蛋白在细胞核内的聚集明显。Western blotting检测发现，TSH刺激的成熟的3T3-L1脂肪细胞、人原代脂肪细胞及小鼠原代脂肪细胞中PPARγ核蛋白表达显著增加。实时定量PCR显示促甲状腺激素刺激的成熟的3T3-L1脂肪细胞PPARγmRNA表达显著增加。利用PPARγ siRNA干扰掉PPARγ后，TSH介导的甘油三酯合成及激活GPAT3的作用被阻断。
　　4、AMPK介导TSH引起的PPARγ/GPAT3上调及脂质合成:体内实验证实，AICAR喂养的TSHR受体敲除的小鼠脂肪组织PPARγ、GPAT3的蛋白、mRNA表达均下降。体外研究显示，转染CA-AMPK抑制TSH引起的PPARγ/GPAT3上调及脂质合成;转染DN-AMPK激活TSH引起的PPARγ/GPAT3上调及脂质合成。
　　5、TSHR参与TSH介导的脂质生成:体内实验证实，TSHR敲除的小鼠表现为体重下降，附睾脂肪重量降低，有较低的附睾脂肪指数。进一步处死小鼠后分别观察了两组小鼠的附睾、肾周白色脂肪组织的外观及脂肪细胞的体积大小(H&E染色)，发现TSHR敲除的小鼠附睾、肾周白色脂肪组织含量较野生型小鼠显著降低，脂肪细胞体积下降。Western显示TSHR敲除的小鼠GPAT3表达下降。通过体外实验证实，利用TSHR siRNA干扰掉TSHR后，TSH介导的甘油三酯合成及激活AMPK/PPARγ/GPAT3的作用被阻断。
　　结论:
　　在成熟脂肪细胞中，TSH通过结合到TSH受体，阻断AMPK Thr172位点的磷酸化，激活PPARγ转录激活系统，进而增加GPAT3的表达，促进肥胖的发生和发展。

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