乳腺癌前病变大鼠动物模型的建立、评价及其发生机制的初步研究

摘要

本文主要从以下几方面进行了论述。
　　第一部分 乳腺癌前病变大鼠模型的建立与评价
　　目的:
　　本研究分别从致癌剂的种类、致癌剂和雌孕激素给药途径、剂量、周期方面，分4次动物实验依次进行，以此探讨能够延长癌前病变窗口期、与人体内环境最为接近的诱发型乳腺癌前病变大鼠模型的最佳方法，为乳腺癌的预防提供动物平台。在建模过程中，引入超声、MRI影像学检测，结合大体形态学观察，参考最终病理学诊断金标准，评价并确定乳腺癌前病变动物模型终点的指标。
　　方法及结果:
　　一，建立乳腺癌前病变大鼠模型。
　　1.实验一:致癌剂DMBA和MNU的选择。随机将SD大鼠分成七组，分别进行如下干预:一组，6只，空白对照组;二组，12只，DMBA100mg/kg一次性灌胃;三组，10只，DMBA100mg/kg一次性灌胃+雌孕激素5天一周期;四组，12只，DMBA100mg/kg一次性灌胃+雌孕激素30天一周期;五组，10只，MNU50mg/kg一次性灌胃;六组，10只，MNU50mg/kg一次性灌胃+雌孕激素5天一周期;七组，10只，MNU50mg/kg一次性灌胃+雌孕激素30天一周期。
　　结果:实验终点前，因致癌剂毒性所致总死亡率DMBA各组（二、三、四组）为38.23％，MNU各组（五、六、七组）为43.33％;实验开始后第120～180天之间， DMBA各组发现癌前病变的大鼠分别为二组5只(62.50％)、三组3只(50.00％)、四组4只(57.00％);至实验终点，DMBA各组所有存活大鼠均出现IBC且集中出现在第150～200天。MNU各组，除第七组发现一只大鼠出现癌前病变外，其余各组均未发现癌前病变。MNU各组最终出现IBC的大鼠数目分别为4、5、5只。MNU组癌前病变检出率低、死亡率高，可能与其毒性更强，使得癌前病变窗口期窄，不易被检出有关。据此在后续的研究中，我们选择DMBA作为癌前病变诱导剂。
　　2.实验二:致癌剂DMBA给药方式一灌胃或腹腔注射的选择。随机将SD大鼠分成六组，每组5只，分别进行如下干预:一组，DMBA60mg/kg一次性腹腔注射+雌孕激素5天一周期;二组，DMBA50mg/kg一次性腹腔注射+雌孕激素5天一周期;三组，DMBA100mg/kg一次性灌胃+雌孕激素5天一周期;四组，DMBA60mg/kg一次性灌胃+雌孕激素5天一周期;五组，DMBA50mg/kg一次性灌胃+雌孕激素5天一周期;六组，DMBA40mg/kg一次性灌胃+雌孕激素5天一周期。
　　结果:DMBA腹腔注射实验组在19天内10只大鼠均死亡，尸检发现大量淡血性腹水，肝、肾体积增大，经病理证实存在肝、肾部分急性坏死。相比之下，灌胃给药各组死亡率较低，但因每组大鼠基数较少，各组间无明显统计学差异。因此我们认为DMBA腹腔注射毒性大，致死率高，在后续实验过程中，均采用DMBA灌胃的给药方式。
　　3.实验三:雌孕激素给药周期—5天或30天的选择。随机将SD大鼠分成四组，分别进行如下干预:一组，6只，对照组;二组，15只，DMBA100mg/kg一次性灌胃+雌孕激素序贯30天一周期;三组，15只，DMBA100mg/kg一次性灌胃+雌孕激素序贯5天一周期;四组，15只，单药DMBA100mg/kg一次性灌胃组。
　　结果:本次实验中，我们增加了每组大鼠数量，DMBA单药、DMBA联合雌孕激素5天一周期、DMBA联合雌孕激素30天一周期进行对比，结果显示，DMBA联合雌孕激素5天一周期组癌前病变检出率(55.60％)高于二组(40.00％)和四组(37.50％)，提示雌孕激素5天一周期有助于稳定大鼠乳腺癌前病变，延长窗口期。
　　4.实验四:致癌剂DMBA剂量和给药次数选择。50只大鼠随机分为5组，每组10只，本次实验采用低剂量分次给药的方式，致癌剂DMBA从10mg/kg到30mg/kg，每组递增5mg/kg，分别在实验开始的第1天、55天、96天三个时间点进行致癌剂干预。
　　结果:研究发现除30 mg/kg组大鼠有50％死亡率外，其余各组死亡率均低于20％。
　　二.建立大鼠乳腺癌前病变模型的评价指标。
　　1.大体形态观察，包括视诊和触诊。
　　2.超声观察内容:肿物边界、界限、形态、内部回声、有无细点状强回声钙化灶、有无后方回声衰减、血流信号Adler半定量分级、内部动脉血流指数。
　　3.MRI观察内容:普通扫描和增强扫描中，腹部皮下组织信号强度、有无异常强化、动态增强血流动力学曲线表现型等。
　　4.病理学观察，所有组织切片均进行HE染色，无法明确诊断者，用免疫组织化学检测乳腺肌上皮分子标记物P63进行进一步诊断。
　　结果:
　　1.在大体形态上，癌前病变大鼠模型表现为乳腺皮肤红润、隆起，乳头增高增大;触诊可及皮下脂肪垫增厚、质软，肿物多呈不规则形、表面不光滑、边界不清。
　　2.超声显示，癌前病变肿物边界多不规整，界限不清，形态不规则，可表现为凹凸不平或有角状凸起;内部回声较低;有时可见细点状强回声钙化灶;少部分有后方回声衰减;血流信号Adler半定量分级Ⅰ～Ⅱ级;内部动脉血流指数RI＞0.7。磁共振T1WI上多呈低或中等信号;增强扫描中，可见异常强化，多为小斑点状强化灶或肿块强化灶、导管样或段样强化;动态增强血流动力学曲线表现为流出型或平台型。
　　3.病理学观察，通过HE染色和P63免疫组化共同确诊，癌前病变分以下几种病理学类型:不典型导管增生（ADH）、导管原位癌(DCIS)、不典型小叶增生(ALH)、小叶原位癌(LCIS)。
　　结论:
　　1.DMBA较MNU毒性低，在乳腺癌前病变建模过程中，可提高大鼠出现癌前病变的机率。
　　2.模型建立过程中，选择DMBA分次小剂量灌胃，可在保障造模效果的同时显著降低各实验组大鼠死亡率。
　　3.雌孕激素刺激大鼠腹部皮下乳腺腺体增生，5天为一周期的给药方式与大鼠体内固有的生理周期（5天）相适应，可规律性出现增生复旧变化，创建了较为适宜的机体内环境，使建模过程中，乳腺癌前病变进程相对延长。
　　4.超声表现为局部不均匀低回声、血流局灶性增强;动态增强MRI中时间-信号强度曲线表现为流出型或平台型，均可以作为癌前病变活体动态观测的参考指标。
　　5.DMBA（15mg/kg第1天、55天、96天分别灌胃）联合雌激素（0.Smg/kg/d腹腔注射）+孕激素（4 mg/kg/d腹腔注射）序贯给药（每5天为一给药周期）能成功建立较稳定的乳腺癌前病变动物模型。
　　第二部分 乳腺癌前病变大鼠模型发生机制的初步研究
　　目的:
　　在已经成功建立乳腺癌前病变大鼠模型的基础上，初步探讨雌激素在其模型中的作用机制。
　　方法:
　　1.采用ELISA实验技术检测模型中正常乳腺组织、癌前病变及乳腺癌组织中2-OH-E2、4-OH-E2和16α-OH-E1的水平。
　　2.应用免疫组化技术检测ERα、ERβ及PI3K-P85α在正常乳腺组织、癌前病变及乳腺癌组织中的表达情况。
　　3.数据处理:应用SPSS20.0进行统计分析。ELISA数据应用MasterPlexReaderFit专业软件进行分析处理。
　　结果:
　　1.2-OH-E2、4-OH-E2和16α-OH-E1含量在大鼠正常乳腺组织、癌前病变及乳腺癌组织中均逐步升高，尤其以4-OH-E2和16α-OH-E1含量增高更为明显（P＜0.001)。
　　2.4-OH-E2与2-OH-E2的比值在大鼠乳腺癌前病变组织中最高，且与正常组织、乳腺癌组织中的比值有统计学差异（P值分别为0.002和0.030）。
　　3.16α-OH-E1与2-OH-E2的比值在大鼠正常乳腺组织、癌前病变及乳腺癌组织中均逐步升高，但仅在正常乳腺组织、癌前病变组织与乳腺癌组织中比值变化有统计学差异(P＜0.001)。
　　4.ERα在大鼠正常乳腺组织、癌前病变及乳腺癌组织中表达范围及总评分逐步增高，正常乳腺组织到乳腺癌前病变的差异最为显著（范围得分:P＜0.001;总评分:P=0.003），而乳腺癌前病变到乳腺癌无明显差异。表达强度在各组间无明显差异。
　　5.ERβ在大鼠正常乳腺组织、癌前病变及乳腺癌组织中表达范围逐步降低，正常乳腺组织与乳腺癌前病变组织差异有统计学意义(P=0.008)，强度无明显统计学差异，总评分中，正常乳腺组织与乳腺癌两组间有统计学差异(P=0.006)。
　　6.PI3K-P85α在大鼠正常乳腺组织、癌前病变及乳腺癌组织中表达范围、强度均逐步增大，范围、强度及总评分在各组间均有统计学差异（P值均＜0.001）。
　　结论:
　　1.乳腺癌前病变大鼠模型中，雌激素主要通过4-OH-E2和16α-OH-E1途径进行代谢。
　　2.乳腺癌前病变大鼠模型中，雌激素主要与雌激素受体途径的ERα结合，启动下游雌激素受体元件，并且使PI3K-P85α表达上调。
　　3.4-OH-E2与2-OH-E2的比值以及ERα表达水平在大鼠正常乳腺组织到乳腺癌前病变组织中的变化特异，可作为乳腺肿瘤诊断的辅助指标。
　　4.人与大鼠雌激素致癌途径基本相似，此模型最大程度的模拟人体内环境致癌过程，具有较高的使用价值。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 乳腺癌前病变大鼠动物模型的建立与评价

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

附表

参考文献

第二部分 乳腺癌前病变大鼠模型发生机制的初步研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

附表

参考文献

致谢

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综述 乳腺癌癌前病变动物模型的建立

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