PTPN18对HER2蛋白的磷酸化水平和泛素化水平的调节作用

摘要

细胞对于生长因子的不正常反应会造成细胞的异常生长，这在人类癌症的发生和发展中起关键作用。HER2目前引起了广泛的关注，因为其高表达预示着乳腺癌，卵巢癌，胃癌和其它癌症等的预后不良。HER2通常被看成是一个孤儿受体，当受到表皮生长因子（Epidermal growth factor，EGF）刺激时，HER2作为EGFR家族的一个成员，与EGFR家族的其它成员形成同源或异源二聚体，进而激活下游的细胞信号通路，影响细胞功能。HER2的C末端酪氨酸残基的磷酸化是由蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases，PTKs)和蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatases，PTPs）两种酶精确协同控制的。其中的蛋白酪氨酸磷酸酶在细胞信号通路中作为一个重要的角色，调控细胞的功能。在不同的刺激条件下，蛋白酪氨酸磷酸酶的调节影响了细胞生长和增殖，细胞周期，细胞骨架等细胞功能。最近的研究发现PTP-MEG2，PTPN12，PTPN13和PTPN18，这些蛋白酪氨酸磷酸酶在特定的细胞环境中参与HER2相关的信号通路;然而，由这些磷酸酶调控HER2的酪氨酸磷酸化的机制从未详细探讨。其中，PTPN18，也叫BDP1，是第一个被发现的针对HER2蛋白的酪氨酸磷酸酶;同时PTPN18的N端是蛋白酪氨酸磷酸酶催化结构区域，C端调控区域富集脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)，因此属于酪氨酸磷酸酶PEST家族。有趣的是，PTPN18只对HER2进行去磷酸化的作用，而不对EGFR或IGF1R的磷酸化的酪氨酸进行去磷酸化。以前的研究发现PTPN18可以调控HER2的磷酸化水平，然而这其中如何调控HER2信号通路的分子机制还不清楚。本论文研究表明PTPN18催化结构域水解底物具有严格的底物特异性，并且发现其C端调控结构域介导HER2泛素化的新功能。
　　研究方法：
　　1)体外蛋白表达纯化
　　通过大肠杆菌-BL21原核表达系统，表达带有GST和HIS标签的不同长度的PTPN18蛋白和部分蛋白酪氨酸磷酸酶家族的蛋白;通过亲和层析和离子交换的方法获得纯度高达95％以上的目的蛋白。
　　2)体外酶活测定
　　以小分子化合物pNPP和带有磷酸化的酪氨酸的短肽为底物，检测PTPN18的催化结构域对这两类底物的催化活力。利用点终止法通过酶标仪进行读数，获得酶活常数Kcat和Km。同时体外检测PTPN18催化结构域对细胞内生理底物—HER2的磷酸酶活力。
　　3)晶体生长及晶体结构解析
　　将纯化的PTPN18的催化结构域陷阱突变蛋白分别与含有HER2的pY1112，pY1196，pY1248这3个酪氨酸位点磷酸化的磷酸多肽混合，悬滴法共结晶，25℃静置3天后收集单晶，并通过X-射线衍射获得衍射数据，解析PTPN18的催化结构域蛋白与HER2磷酸短肽复合物的晶体结构。
　　4)免疫共沉淀(CO-IP)技术
　　在哺乳细胞HepG2细胞和MCF-7细胞中，过表达或干扰PTPN18以及β-TRCP后，通过免疫共沉淀的方法检测PTPN18与其它蛋白的相互作用以及PTPN18对HER2蛋白泛素化的影响。
　　5) GST-pulldown实验
　　将体外纯化的带GST标签的不同截短的PTPN18蛋白与细胞内HER2蛋白进行共孵育，检测不同截短的PTPN18蛋白对HER2蛋白的结合能力。
　　6) MTT方法
　　在HepG2细胞内过表达PTPN18不同的突变质粒或干扰PTPN18，通过加入MTT观察24-72小时的细胞增殖状态。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死的细胞没有这种功能。在酶联免疫检测仪(OD570 nm)测定其光吸收值，间接反映活细胞的数量，从而反映PTPN18对细胞增殖的影响。
　　7) Transwell方法
　　在HepG2细胞内过表达PTPN18不同的突变质粒，加EGF刺激后，利用结晶紫染色，检测不同时间点内各个突变体对该细胞的侵袭的能力。
　　8)免疫荧光染色
　　在HepG2细胞内过表达PTPN18的野生型和D197A突变体，用单克隆抗体RPN12(蛋白酶体途径的标记物)和Lamp1（溶酶体途径的标记物）检测PTPN18对HER2蛋白的分布、降解的调控作用。
　　9) Western Blot
　　在细胞系中对PTPN18进行干扰后，加EGF刺激检测在不同时间点HER2和EGFR的C末端不同的酪氨酸位点的磷酸化水平。
　　在细胞系中过表达PTPN18野生型及不同的突变型，加EGF刺激后检测PTPN18对HER2的C末端不同的酪氨酸位点的磷酸化水平，以及对HER2相关信号通路（增殖，迁移和HER2蛋白降解）的影响。
　　在细胞系中过表达HER2的C末端质粒，加EGF刺激后IP纯化HER2C末端蛋白，与纯化的PTPN18的催化结构域蛋白进行体外酶活分析，利用Western检测PTPN18对HER2的C末端不同的酪氨酸位点的磷酸化水平。
　　在细胞系过表达PTPN18野生型及不同的截短及失活突变后，检测PTPN18对HER2蛋白的结合能力。
　　在多种乳腺癌细胞系或人乳腺癌组织样品中，检测PTPN18蛋白与HER2蛋白的表达量以及相关性。
　　10)统计分析
　　所有实验均重复3次以上，应用Image J分析软件对Western Blot进行蛋白定量分析;应用Graphad Prism5统计软件进行酶活数据的分析;所有数据均采用±标准误表示，采用单因素方差分析和t检验对相关数据进行统计分析，以P＜0.01用**或＃＃进行标记，以P＜0.05用*或＃进行标记。
　　结果：
　　我们在蛋白分子水平和细胞水平研究并阐明了PTPN18的N端催化结构域和C端调控结构域对其底物HER2的调控作用。研究发现，PTPN18通过N端磷酸酶催化结构域对HER2的去磷酸化以及C端PEST结构域对HER2的泛素化进行精确调控，从而调控HER2介导的细胞内信号通路。具体结果如下:
　　1)我们对PTPN18和HER2进行体外酶活性的测定和晶体结构的解析阐明了PTPN18对HER2的C末端不同的磷酸化位点具有选择性。我们解析了PTPN18催化结构域陷阱突变与磷酸多肽的复合物晶体结构（PTPN18与含有HER2的pY1112，pY1196，pY1248磷酸化位点的3个磷酸多肽的晶体复合物），并发现PTPN18中的催化区结构域对HER2的C末端的磷酸化的酪氨酸去磷酸化的选择特异性及结构基础。PTPN18与HER2的pY1112，pY1196，pY1248这3个磷酸多肽的晶体结构复合物同时显示了以下两种特殊的结构特征:(1) HER2短肽的pY+1位氨基酸残基与PTPN18具有疏水相互作用，可以选择性调节两者之间的作用。(2)PTPN18的第198位的精氨酸侧链的可塑性，其侧链对两种短肽底物的识别具有重要意义。
　　2)我们研究发现PTPN18对HER2的不同磷酸化位点的特异性作用抑制了HER2介导的细胞增殖和细胞迁移。在细胞系中，过表达PTPN18野生型及不同突变型，发现PTPN18特异性去磷酸化HER2的C端第1196位和1248位酪氨酸的关键氨基酸(hot spot);阐明了PTPN18降低HER2的C末端的第1196位和第1248位的酪氨酸磷酸化水平，从而对HER2介导的细胞增殖和侵袭具有负向调控作用的分子机制。
　　3)我们研究发现PTPN18的C端PEST调控结构域介导HER2泛素化的新功能。虽然PTPN18的催化结构域通过去磷酸化HER2的C末端第1112位酪氨酸的磷酸化，而减少与E3泛素连接酶c-Cbl的结合，从而延迟了HER2蛋白的溶酶体降解途径，但是PTPN18的PEST结构域可以促进泛素蛋白K48介导的HER2蛋白的泛素化进而引起蛋白酶体的降级途径。其中我们发现，PTPN18的C端第419-423位氨基酸序列中S419/S423磷酸化后与β-Trcp结合，通过“AKT-PTPN18/β-Trcp-HER2”泛素化途径对HER2蛋白有降快速解作用。PTPN18切换HER2的泛素化和降解的路线，这既需要PTPN18 N端的催化结构域和C端的PEST结构域。
　　4)在乳腺癌细胞系和乳腺癌组织样品中，我们发现PTPN18对HER2介导的信号通路具有负调控作用。PTPN18与HER2的蛋白表达水平比值与乳腺癌的分期负相关。本研究不仅探讨了PTPN18与HER2相互作用的详细的分子机制，而且发现了PTPN18的PEST结构域的新功能，对乳腺癌的诊疗具有深远意义。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 PTPN18的催化结构域和PEST结构域分别对HER2蛋白的磷酸化水平和泛素化水平具有调节作用

1．1 前言

1．2 研究目的

1．3 材料与方法

1．3．1 实验材料

1．3．2 实验方法

结果

1．4 实验结果分析

1．5 讨论

参考文献

致谢

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