泛素化调控Ras超家族GTP酶蛋白水平与Nedd4介导Ar11泛素化降解的研究

摘要

Ras超家族GTP酶是细胞内信号转导通路中重要的分子开关,参与调控着众多的生理生化过程,包括基凶表达、细胞生长分化、膜泡运输、细胞核质信息交换、细胞运动、细胞周期等。Ras家族中的许多成员与人类肿瘤癌症的发生于发展有着密切关系,为人们所关注。现已证实,Ras超家族中的不少成员可以被泛素化修饰,如RhoA和Rap1B。这种泛素化修饰和传统的GTP/GDP结合形式转化经典途径一同影响着小G蛋白的表达水平和活性,对于调控细胞的各种生理生化作用起着重要作用。
　　 本文中,我们希望通过相关实验,系统性地了解Ras超家族GTP酶泛素化调控机制和生物学功能。将人源的Ras超家族成员克隆到带有Flag标签的哺乳动物细胞表达载体中,计划构建Ras超家族所有成员的完整质粒库。目前,已经成功克隆出大多数的Ras超家族成员。对已构建出来的Ras成员,我们用C2-WW-HECT家族泛素连接酶成员对其进行初步筛选:检测五种E3泛素连接酶对Ras蛋白水平的影响。经过系统性的筛选,我们比较肯定的结果是:有20多个Ras超家族成员的蛋白水平受到C2-WW-_HECT家族泛素连接酶的影响而下调。
　　 为了确定初筛的结果,我们选取其中的一个阳性结果Arl1和对应的E3Nedd4-1,进行深入研究。通过Nedd4-1对Arl1蛋白水平的调控、溶酶体抑制齐J对其降解的抑制作用的研究,我们确定了Nedd4-1对.Arl1蛋白水平具有下调的作用,并通过溶酶体途径完成。其次,Nedd4-1与Arl1在细胞内和体外条件下的相互作用以及体内体外泛素化情况等方面,也证实了Nedd4-1可以直接与Arl1结合,并泛素化调控Arl1的降解。