TERT启动子突变及SMYD3在尿路上皮癌中的研究

摘要

背景：
　　尿路上皮癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，近些年以来其发病率在世界范围内呈逐年上升的趋势，目前其发病机理尚未明确。端粒长度和端粒酶活性的调节在人类衰老及肿瘤等疾病发生中发挥着重要作用。端粒存在于真核生物染色体末端，是由8-20kb串联重复的DNA(TTAGGG)序列及其相关蛋白质所组成。端粒可以提供非转录DNA的缓冲物且在保护染色体末端免于融合和降解、染色体定位、复制、保护和调控细胞生长及寿命方面具有重要作用。端粒酶是一种由蛋白质和RNA构成的核糖核蛋白体，为RNA依赖的DNA聚合酶，能将端粒片段加至端粒末端。作为端粒酶维持结构与功能的必需元件——端粒酶结合蛋白发挥着重要作用，而其中最重要的是端粒酶蛋白复合体，它可以调控3'的尾及t-环形成，是由TRF1（TTAGGG-重复序列结合因子1），TRF2，TIN2，RAP2，TPP1及POT1构成。端粒酶功能主要由端粒酶逆转录酶(telomerase reversetranscriptase，TERT)和端粒酶RNA组分通过在染色体末端合成端粒重复序列完成。TERT基因位于染色体5P15.33，正常体细胞携带2倍复制的TERT基因，如基因复制减少或增加都会出现异常。TERT复制增加会导致肿瘤的发生。超过30％的人类恶性肿瘤携带超过3倍的TERT基因复制。TERT启动子富含GC，缺少TATA盒及CAAT盒，其至少包含5个SP1结合位点，2个E-boxes以及1个转录起始位点，可以结合多功能转录因子TFII-Ⅰ，研究表明TERT转录机制受控于多个转录因子，如c-Myc，SP1，Survivin，STAT3，EWS-ETS，HIF-1α，Mad/Max，P53，WT1，Rb，TGF-β/Smad，AP1等。TERT启动子点突变在激活端粒酶的过程中起着重要作用。近期研究证明表遗传学在尿路上皮癌的发生发展中起着重要作用，其中包括组蛋白修饰酶介导的PI3K-AKT信号通路作用，SMYD3(SET and MYND domain-containing protein3)是新近发现的组蛋白甲基化酶，其可以识别并结合下游靶基因启动子的特异性序列(CCCTCC)，从而引起组蛋白H3-K4双甲基化/三甲基化，进而导致靶基因转录功能的改变。尽管SMYD3在人体正常组织中表达较弱或呈不表达状态，然而其在前列腺癌、结肠癌、肝癌和乳腺癌等许多肿瘤的发生及发展过程中呈现过表达状态，并在肿瘤发生及进展过程中起着至关重要的作用。在本研究中我们将探讨TERT启动子突变及SMYD3在尿路上皮癌中的情况及其临床意义。
　　目的：
　　本研究将检测TERT启动子在尿路上皮癌中突变情况和组蛋白甲基化酶SMYD3在下尿路膀胱尿路上皮癌(BC)中的表达情况以及其与尿路上皮癌患者临床病理间的相关关系，并通过体外细胞实验，对SMYD3在膀胱癌中的生物学功能和作用机制进行初步研究。
　　方法：
　　采用Sanger测序法检测98例肾盂癌，122例输尿管癌，182例膀胱尿路上皮癌肿瘤组织，癌旁正常组织及与以上标本对应的20例输尿管癌患者手术前尿液，16例肾盂癌患者术前尿液，102例膀胱癌患者术前尿液，46例术后尿液标本TERT启动子的突变情况并分析TERT启动子突变与肾盂，输尿管，膀胱尿路上皮癌的临床病理关系;采用castPCR法对以上患者尿液标本进行TERT启动子突变的检测，分析其与Sanger法在检测敏感性和特异性上的差异性;在膀胱癌标本中检测FGFR3-7/10/15的突变情况，并分析其与患者临床病理及TERT启动子突变间的相关性。
　　运用实时荧光定量PCR(Realtime-PCR)检测25例膀胱癌组织及其癌旁膀胱粘膜组织中SMYD3的表达情况，通过蛋白印迹实验检测膀胱尿路上皮癌中SMYD3的表达情况，使用卡方检验分析SMYD3免疫组化染色结果与膀胱癌患者临床病理间的关系，然后，我们选用膀胱尿路上皮癌典型细胞系T24和5637进行体外细胞实验研究，运用特异性shRNA或siRNA转染细胞，对T24和5637细胞的SMYD3的表达进行抑制，在抑制后72小时内，我们使用RT-PCR及Western-Blot检测SMYD3，PI3K-AKT通路及其他肿瘤相关基因在膀胱尿路上皮癌细胞系中的表达情况。运用克隆形成实验(Colony formation assay)检测SMYD3与膀胱尿路上皮癌间的增殖关系;运用Transwell细胞迁移(Cell migration assay)，侵袭实验(Matrigel invation asssay)检测SMYD3与膀胱尿路上皮癌间的迁移及侵袭关系，运用流式细胞仪检测抑制SMYD3基因后，膀胱尿路上皮癌细胞凋亡及周期变化情况，采用稳定转染技术转染SMYD3后，应用裸鼠体内细胞成瘤实验检测抑制SMYD3后，膀胱尿路上皮癌细胞在裸鼠体内增殖情况。
　　结果：
　　我们通过Sanger法对220例上尿路尿路上皮癌的肿瘤组织和癌旁正常组织进行TERT启动子测序研究发现，癌旁正常组织无突变发生，肿瘤组织中有43％肾盂癌(42/98)发生TERT启动子突变—其中38例为C228T突变，4例为C250T突变;另外有19％输尿管癌(23/122)发生TERT突变—其中15例C228T突变，7例C250T突变，其中远处转移组突变明显高于未转移组(P=0.013)，在输尿管癌中突变与年龄呈正相关(P=0.001)，以上结果表明TERT启动子突变与肿瘤的远处转移呈正相关，与患者的性别(P=0.646)，临床分期(P=0.216)，病理分级(P=0.239)，肿瘤大小(P=0.825)及周围淋巴转移(P=0.069)无相关性。TERT启动子突变在上尿路尿路上皮癌中总的突变率为27％，突变与肿瘤的远处转移呈正相关;在36（其中10例组织发现TERT启动子突变）例收集过尿液标本的上尿路肿瘤及70例下尿路膀胱肿瘤患者中，我们通过分别用Sanger法及castPCR法检测标本TERT启动子突变情况，通过分析我们发现两种方法的检出结果显示检出率分别为50％和89％。另外我们用Sanger法对182例中国汉族患者肿瘤组织及102例肿瘤尿液标本分析发现， TERT启动子和FGFR3突变分别为87/182(47.8％)和7/102(6.7％);46例组织TERT启动子突变患者的的尿液中，检测到TERT启动子突变的有24(52％)例，这些突变患者手术后一周尿液样本检测发现大部分(80％) TERT启动子突变消失;在尿液中检测TERT mRNA表达情况，我们发现46/49(94％)的标本中检测到TERT表达。
　　通过对SMYD3的研究我们发现，实时荧光定量PCR实验结果显示:SMYD3在膀胱癌组织中的表达(0.152±0.031)较之癌旁组织(0.00039±0.0015)明显升高(P=0.0426)。65例膀胱癌切片标本中，经免疫组织化学实验检测显示，8例(12％)细胞核SMYD3呈强染色，58例(89％)细胞质染色，癌旁正常组织中仅个别样本表现为细胞质局部区域的弱染色(P＜0.01)。免疫染色强度与膀胱癌患者的病理分级(P＜0.01)，临床分期(P＜0.01)，淋巴转移(P=0.036)密切相关，与患者的性别(P=0.494)，年龄(P=1.00）无相关性。体外细胞实验结果显示，运用特异性shRNA或者siRNA转染细胞，对T24及5637细胞的SMYD3的表达进行抑制，在抑制后72小时内，我们采用Western-Blot法检测，siRNA和shRNA干扰SMYD3后其在两种细胞系中的表达明显受到抑制;CCK-8实验结果显示SMYD3被抑制后细胞生长率也随之受到明显抑制，克隆形成实验结果显示，抑制SMYD3后实验组两种细胞的单克隆数量明显低于对照组;裸鼠体外成瘤实验结果显示，稳定转染两种细胞系后裸鼠皮下瘤细胞种植，8周后显示两个细胞系实验组肿瘤大小明显小于对照组(P=0.017，P=0.019)。流式细胞分析实验结果显示，抑制SMYD3表达后，两种细胞系的凋亡较对照组明显升高，细胞周期较对照组明显受到抑制;使用Western-Blot检测shRNA抑制SMYD3后相关蛋白表达情况，结果显示与对照组相比，实验组促细胞凋亡蛋白P53，Bax及Bad表达明显上调，抑制凋亡相关蛋白Bcl-2明显下调，细胞周期相关蛋白cyclinD1，CDK4，cyelinE1，CDK2的表达受到明显下调，p21，p27的表达明显上调。细胞Transwell迁移及侵袭实验结果显示与对照组相比，实验组两种细胞系的迁移能力均明显受抑。使用Western-Blot检测shRNA抑制SMYD3后结果显示与对照组相比，实验组SMYD3靶分子PI3K-AKT通路相关蛋白P-PI3K，P-AKT的表达明显下调。
　　结论：
　　综上所述，在尿路上皮癌的组织及尿液中存在TERT启动子突变现象，并且其在上尿路肾盂尿路上皮癌及下尿路的膀胱尿路上皮癌的突变率要明显高于输尿管尿路上皮癌;在上尿路上皮癌中TERT启动子突变与肿瘤的远处转移呈正相关;TERT启动子突变或许可以成为检测肾盂癌及膀胱癌复发的一个诊断标志，而在中国汉族人群中膀胱癌FGFR3突变发生率非常低，不能作为膀胱癌诊断标志。SMYD3在膀胱尿路上皮癌中表达水平上调;SMYD3基因沉默可以有效抑制膀胱尿路上皮癌细胞的生长;SMYD3可能通过调控细胞凋亡及周期相关蛋白影响膀胱尿路上皮癌的进展;SMYD3可能介导PI3K-AKT通路，从而有助于膀胱尿路上皮癌的侵袭转移。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 TERT启动子突变在尿路上皮癌中的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

第二部分 SMYD3促进膀胱癌发生的机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

致谢

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