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第17届全国干扰素及细胞因子学术会议

第17届全国干扰素及细胞因子学术会议

  • 召开年:2011
  • 召开地:银川
  • 出版时间: 2011-08

主办单位:中国微生物学会

会议文集:第17届全国干扰素及细胞因子学术会议论文集

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  • 摘要:干扰素是一类高活性多功能的诱生蛋白,是机体自身产生的一个抵抗外来病毒入侵,维持机体自我稳定的防御性物质。人体内存在着低浓度的干扰素,形成了机体对病毒感染的自然屏障。在病毒感染过程中,产生内源性干扰素,是一个最普遍的现象。内源性干扰素的产生,是病毒感染的结果,反过来又能对多种病毒产生抵抗。理想的内源性干扰素诱生剂,是诱生干扰素的能力强,又无毒副反应的诱生剂。本文介绍了口含干扰素诱生剂的作用机理与用药剂量,并总结了其在临床上的应用。
  • 摘要:细胞因子主要包括趋化因子、生长因子、血管生成因子和蛋白酶等,其在许多疾病活动中起到关键作用。越来越多的证据表明,包括癌症在内的许多疾病的发生、发展都与其复杂的细胞因子网络有关,疾病活动中细胞因子网络的检测分析对鉴定疾病生物标志物,推进治疗药物开发、最终加快基础和临床研究起到重要作用。酶联免疫吸附试验(ELISA)法是测定细胞因子表达水平最常见的免疫学方法之一,但该方法只适合单因子检测分析。抗体芯片技术是近年快速发展起来的高通量免疫检测分析方法,它的成功应用对微量样品多因子的检测和鉴定起到了很好的推进作用。利用抗体芯片技术,可以一次性检测样品中数百个细胞因子,具备节省样品、省时、省力和节省成本等优势。抗体芯片已经成熟应用到癌症等多种疾病的生物标志物筛选和鉴定研究中,越来越多不同方向的生命科学研究开始使用抗体芯片技术。本文旨针对细胞因子抗体芯片技术在检测癌症等疾病发生、发展中的应用作一介绍。
  • 摘要:碱性成纤维细胞生长因子(baLsic firoblast growthfator,bFGF)是成纤维细胞生长因子家族的一员,可通过自分泌或旁分泌的方式促进多种细胞,包括肿瘤细胞,血管内皮细胞的增殖、分化,与肿瘤生长、转移、耐药有关。用抗bFGF抗体阻断其活性被认为是一种治疗肿瘤的有效方法。在前期构建的鼠源bFGF单抗库及人源噬菌体展示库基础上,筛选抗bFGF中和性抗体,并在体内外研究其抑瘤效果。通过鼠源bFGF单抗库及人源噬菌体展示库成功筛选出多株扰bFGF中和性抗体,在体内外均表现有抑制血管生成及抑制肿瘤生长的作用,本研究为研制新的肿瘤抗体药物奠定前期基础。
  • 摘要:宿主遗传因素在感染性疾病的发生发展中起着重要作用,与单基因疾病不同,感染性疾病的基因研究存在较多困难和问题。本文对目前感染性疾病基因研究的策略和方法做一综述。
  • 摘要:Interleukin(IL)-28B(Interfeton lamlbda 3,IFN-λ3)是一类属于IFN-λ九家族的新型白细胞介素,编码基因位于19号染色体上。近期的多项研究阐述了IL-28B的基因多态性(Singlenucleotide polymorphisms,SNPs)在丙型肝炎病毒(hepatitis C virus HCV)治疗上的重要性,并成功的定位了两个关联性最强的SNPs:rsl2979860-IL-28B上游3kb处,rS8099917-IL-28B上游8kb处。IL-28B的基因多态性具有很好的临床应用前景,根据其基因型可以预测患者的自愈率,以及对聚乙二醇干扰素-α(pegIFY-α)和利巴韦林(ribaVirin,RBV)联合治疗的持续应答率,从而有助于确定HCV感染者的个性化治疗方案。
  • 摘要:骨髓干细胞是一类具有自我增殖和分化潜能的细胞,主要包括造血干细胞和间充质干细胞。体外通过生长因子,体内利用特定的微环境均可诱导骨髓干细胞分化为肝前体细胞和成熟肝细胞,并明显改善肝功能。有望成为肝细胞移植或生物人工肝支持系统的新型种子细胞。本文就骨髓干细胞分化为肝样细胞及其临床治疗肝病做一综述。
  • 摘要:背景:虽然人们对铅毒性引起机体的损害有了较深入认识,但铅负荷儿童与T细胞亚群表达的关系还不十分明确。目的:评估铅负荷儿童T细胞亚群表达以及铅水平与T细胞亚群细胞表达的关系。设计:对比观察。单位:山西省儿童医院妇幼保健院分子微生物研究所。对象:选择2003-05/2003-10太原市南郊和北郊区儿童120人,男62人,女56人;年龄3~6岁,平均(4.54±1.5)岁。监护人均对检测项目知情同意。根据血铅值将儿童分为3组:>0.48μmol/L组(n=26),≥0.24μmol/L,<0.48μmol/L,组(n=40),<0.24pmol/L组(n=54)。方法:①采用石墨炉原子吸收光谱法测定血铅水平。T细胞亚群检测用免疫荧光法。②计量资料差异性比较采用t检验。血铅与T细胞亚群关系采用直线相关分析。主要观察指标:①不同血铅水平儿童T细胞亚群表达比较。②血铅水平与T细胞亚群的关系。结果:120名儿童均进入结果分析。①≥0.48μmol/L组儿童IL-2R.NK表达明显高于<0.24μmol/L组(t:3.18,3.09,P<0.05)。②以血铅含量0.48μmol/L.,0.24μmol/L为分界。结果高铅组与低铅组T细胞亚群表达差异有显著性,铅分界值越高T细胞亚群改变越明显。结论:铅水平≥0.48μmol/L,T细胞亚群表达差异显著,铅分界值越高T细胞亚群表达差异越明显,不同的铅水平对T细胞亚群有不同的影响。不同的铅水平与T细胞亚群表达问有不同的正相关关系。铅对小儿T细胞亚群表达表达有不良影响。
  • 摘要:黑色素瘤(melanoma)是一种恶性程度较高的黑色素细胞肿瘤,多发生于皮肤,也见于接近皮肤的粘膜,尽管早期发现,适当的手术切除和一些辅助治疗能改善其结果,但预后很差,在美国2009年诊断为黑色素瘤者有6000例,近8000人由于此病而死亡,是治疗最困难的恶性疾病。根据我们在国内应用干扰素α的经验,在开始治疗时用小剂量,然后逐步加大剂量,使机体有适应过程,直至最大剂量维持较长时间,这样可以达到大剂量治疗的效果,而不良反应明显降低,值得推荐在治疗黑色素瘤这样恶性肿瘤中应用。不同类型的IFNα对疗效和不良反应也有影响,而我国研究,开发和生产的干扰素αlb(IFNα1b)在临床应用中,同样重量(μg) IFNα1b其效果至少不比IFNα2a和IFNα2b为差,但不良反应明较轻,因此可以考虑用于黑色素瘤的治疗。目前PEG-IFNα己成市场上主流制品,PEG-IFNα1b正在研制中,希望早日投入市场,并积累较多的经验,为广大患者供有效但不良反应较轻的制品。
  • 摘要:用400单位/片的精制人白细胞干扰素制成片剂,用小鼠做动物模型,口腔粘膜给药,对生产工艺、药理学及毒性的研究进行了总结并加以概述。
  • 摘要:目的:ING4(肿瘤生长抑制因子4)和IL-24(白细胞介素24)双基因共表达腺病毒载体对MDA-MB-231乳腺癌细胞的抑癌增效作用。方法:将Ad-ING4-IL-24腺病毒感染人乳腺癌MDA-MB-231细胞,用RT-PCR法、Western blot法检测ING4和/或IL-24基因在肿瘤细胞中的转录和表达;MTI法、Hoechst33258染色法和FCM检测ING4和/或IL-24基因的表达对乳腺癌细胞的生长抑制、周期分布和凋亡效应: RT-PCR检测凋亡相关基因的转录;ELISA法检测VEGF、Ang-1的分泌水平;在乳腺癌的裸鼠移植瘤动物模型上,检测Ad-ING-IL-24对移植瘤生长的抑制作用,并通过免疫组化法检测Bcb2,Bax,Caspase-3等与细胞凋亡相关因子的表达。结果:ING4和IL-24基因可在MDA-MB-231细胞中成功转录及表达,并对乳腺癌细胞增殖有明显抑制作用,并能引起细胞周期中G2/M期阻滞及细胞凋亡,可呈现典型细胞凋亡形态学变化,其凋亡机制可能与Bax/Bcl-2比值升高、Survivin降低有关;VEGF、Ang-1表达下降;动物实验表明Ad-ING4-IL-24能显著抑制移植瘤生长,瘤重抑瘤率达88.1%,具有抑瘤增敏协同作用(Q=1.29>1.15);免疫组化结果显示Ad-ING4-IL-24能明显上调与细胞凋亡相关的因子Bax和Caspase-3的表达和下调Bcl-2、Survivin和CD34的表达。结论:Ad-ING4-IL-24在肿瘤基因治疗中是非常理想的抑癌增效载体。
  • 摘要:STY39是本室研制的新型α-黑素细胞刺激素(α-melanocyte.stimulating hormoneα-MSH)类似物,与α-MSH相比有较强的MClR和MC5R受体选择性,具有抗炎和免疫调节作用。以往的研究显示,STY39对实验性失血性休克加LPS二次打击导致的急性肺损伤(ALI)以及致死性内毒素血症的肺部炎症都有显著的保护作用,但其机制尚不清楚。肺部的实质细胞尤其是Ⅱ型肺泡上皮细胞(alveolarepithelial cell type Ⅱ,AECⅡ或ATⅡ)在生理情况尤其是病理条件下能表达MHC分子,分泌多种细胞因子、炎症介质,参与炎症细胞的相互作用,故被看作肺部的一类重要免疫调节细胞,在ALI以及肺纤维化进程中发挥重要作用。
  • 摘要:目的:以人脐血CD34+造血干/祖细胞为种子细胞,探讨其体外分离、纯化、诱导扩增和分化为内皮细胞的可行性,以及丝素材料对其生长、粘附、分化等情况的影响。方法:采集新鲜脐血经抗凝处理及无菌包装,Ficoll密度梯度离心法得单个核细胞,磁珠分选方法(MACS)分离出CD34+单个核细胞,分别接种到经丝素蛋白膜(SF)和明胶包被的培养皿上,用含有内皮细胞生长因子(VEGF)和纤维细胞生长因子(bFGF)的M199培养基诱导分化,胞形态学观察D34+细胞生长情况,流式细胞仪检测诱导前后内皮细胞CD34,CD3l及vWF表型,电镜观察验证内皮细胞胞浆内的W-P小体,并比较不同材料上D34+细胞的贴壁率及向内皮细胞分化比率。结果:分离后的细胞中D34+细胞经流式细胞仪测定。细胞比例为(95.68±1.06)%。细胞形态学观察发现,SF组和明胶组D34+细胞培养2周细胞长满瓶底并达到增殖高峰,细胞呈“铺路石”状排列。经诱导培养10d后,SF组和明胶组内皮细胞表型CD31阳性率分别为(68.03±4.89)%和(68.89±3.58)%,培养140d后,两组细胞vWF阳性率均可达80%以上。透射电镜两组细胞胞浆内均可见内皮细胞的Weibel-Palade小体。CD34+细胞在明胶和SF上均可较快贴壁,平均贴壁率为90.8%和85.2%,同时两组内皮细胞的分化比率均能达到60%以上,无明显差异。结论:脐血D34+造血干/祖细胞在VEGF等细胞因子的诱导下有可能定向分化为内皮细胞,同时可用SF作为其向内皮细胞分化的支架材料,最终用于具有快速形成毛细血管网能力的组织化器官替代品。
  • 摘要:1995年发现的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL),是肿瘤坏死因子超家族成员之一,属于Ⅱ型跨膜蛋白。本研究中,尝试将人TRAIL114-281三聚体的三个单体的氨基酸片段以两段柔性氨基酸短臂(GGGS)3,头尾相连,使之融合成为一条多肽链scTRAIL,即:TRAIL114-281-(GGGS)3-TRAIL114-281-(GGGS)3-TRAIL114-281,以增强抗肿瘤的效果。通过PCR和限制性内切酶酶切、连接技术,获得编码单链化蛋白scTRAIL的基因序列,构建了含编码人scTRAIL基因的重组质粒,在宿主菌E.coli BL2I中得到了较高水平的表达,并用麦芽糖结合蛋白亲和层析柱对表达产物进行了初步纯化,获得了融合了麦芽糖结合蛋白标签的可溶性重组蛋MBP-scTRAIL。用ICR小鼠作为实验动物,腹腔注射MBP-scTRAIL溶液,连续观察14天,检测其急性毒性。结果表明,MBP-scTRAIL的抗肿瘤活性明显高于MBP-TRAIL114-281;在动物急毒实验中,MBP-scTRAIL未对实验动物表现毒性,对正常机体组织无损伤。预示着该蛋白在肿瘤临床治疗上具有良好的应用前景。
  • 摘要:本实验以人胰腺癌细胞系PANC-1为研究对象,采用无血清悬浮培养法培养肿瘤干细胞球,进一步分析其生物学特性,指出胰腺癌肿瘤细胞中有肿瘤干细胞的存在;能使用无血清培养法分离畜集干细胞,为后续的研究提供基础。
  • 摘要:目的:探究肝纤维化发生原因,发展的后果及有效的治疗方法。材料及方法:本文统计乙肝肝纤维化39例、肝硬化57例,青中年为主,血吸虫肝性肝纤维化16例,晚血肝硬交67例,老年人为主,酒精性肝纤维化19例,酒精性脂肪肝纤维化13例,中年人为主。心源性肝纤维化3例,中老年人,合计214例。对乙肝纤维化分别用干扰素α-2b,硫普罗宁,秋水仙硷治疗,对血吸虫病性肝纤维化分别用心肝宝(发酵虫草头孢菌丝),硫普罗宁治疗,对酒精性肝纤维化用多烯磷酯酰胆硷及硫普罗宁治疗.结果:乙肝纤维化组干扰素α-2b,有效率57.9%为最佳,与其他两组比较P值均>0.01,硫普罗宁5.7%,秋水仙硷28.9%有效,该两组无显著差异P值<0.05。血吸虫病肝纤维化组,心肝宝8.3%,硫普罗宁2.8%有效,以心肝宝为优,P值<0.05。酒精性肝纤维化均能治愈,但若合并脂肪肝则只能使其好转。结论:经长期追踪观察认为,肝纤维化若早期给予有效的治疗病变是可逆的,否则可以发展为肝硬变,此时病变已不可逆,再不治疗少数病例可因基因突变成为肝癌,亦可因门高压上消化道大出血,腹水感染导致休克,肝功能衰竭肝性脑病造成不良后果。
  • 摘要:目的:探讨中药抗肝纤冲剂对免疫损伤小鼠肝纤维化的疗效及作用机制。方法;正常Balb/c小鼠75只,随机分为五组,正常对照组(A组),肝纤维化模型组(B组),秋水仙碱组(C组),抗肝纤冲剂低剂量组(D组),抗肝纤冲剂高剂量组(E组),每组15只。参照腹腔注射猪血清方法制备肝纤维化小鼠模型。A组给予等量生理盐水;各药物组于造模的同时,给予相应剂量的药物灌胃;C组给予0.1mg/kg秋水仙碱肌注;D组于每40mg/kg抗肝纤冲剂溶液灌胃;E组每80mg/kg抗肝纤冲剂溶液灌胃。B组以等量生理盐水灌胃。每天一次,连续7周。观察各组小鼠肝、脾指数;肝功能生化指标;肝组织病理HE染色,观察病理变化;Masson法胶原特殊染色,观察肝组织纤维增生情况;免疫荧光法检测Smads2/3及Smads6/7;实时定量PCR法检测col-I与col-IVmRNA水平;免疫印迹法检测肝内TGF-βl与col-ImRNA的表达。结果:1,比较各组小鼠肝、脾脏器系数,经SPSS10.0方差分析,结果显示,模型组肝、脾脏器系数比正常组显著增加(P<0.01);各用药组与模型组比较,肝、脾脏器系数明显降低(P<0.05或0.01)。2.各组小鼠血清肝功能指标恢复情况:结果显示,模型组ALT,TP值明显高于正常对照组(P<0.01, P<0.05); A/G值明显低于正常对照组(P<0.01)。各药物治疗组与模型组相比,皆可降低ALT值,而A/G值升高,差异有统计学意义(P<0.05)。其中抗纤维化高剂量组与模型组相比,差异显著(P<0.01)。3.肝组织HE染色,各用药组肝组织损伤情况均有所好转,其中抗肝纤冲剂高剂量组,鼠肝细胞组织结构多处于接近正常状态。4.胶原特殊染色显示,各用药组与模型组比较,胶原明显减少。5.免疫荧光法显示,各用药组Smads2/3表达明显降低,而Smads6/7表达明显增加,其中抗肝纤冲剂高剂量组更为明显。6.实时定量PCR法检测基因col-Ⅰ与col-ⅣmRNA水平显示,抗肝纤冲剂治疗组可抑制col-Ⅰ,Ⅳ型胶原基因的表达,与模型组比较,有显著性差异(P<0.01)。7.免疫印迹法检侧肝组织中TGF-β1和Ⅰ型胶原蛋白表达显示,各用药组表达量明显减少,其中抗肝纤冲剂高剂量组尤为明显。表明抗纤冲剂低剂量组则可以抑制肝内TGFβ1及Ⅰ型胶原基因蛋白的表达,与模型组相比差异显著(P<0.01)。结论:抗肝纤冲剂有较好的改善实验鼠肝纤维化的治疗作用。抗肝纤冲剂抗肝纤维化的作用机理,可能与通过TGF-β1/Smad信号转导通路抑制肝内胶原蛋白的表达,从而起到阻断肝纤维化的治疗作用。
  • 摘要:目的:构建抑瘤素M(OSM)重组腺病毒载体,研究其对人黑色素瘤细胞A375的抑制作用。方法:以PEGZ-OSM重组质粒为模板,通过PCR技术扩增出OSM片段,采用腺病毒载体的基因重组和体外包装技术获得表达与人OSM氨基酸序列相同的重组腺病毒子Ad-OSM,感染A375细胞,用荧光显微镜、RT-PCR、western blot法检测0SM在A375细胞中的转录和表达;荧光显微镜观察A375细胞的形态学改交; MTT法和流式细胞术(FCM)检测Ad-OSM对A375细胞的生长抑制和凋亡效应。结果:基因测序和PCR分析结果显示,成功构建了Ad-OSM腺病毒表达载体;RT-PCR和western blot法检测到0SM基因在A375细胞中的转录和表达;OSM基因的表达对A375细胞增殖有明显抑制作用,并可诱导细胞凋亡。结论:成功构建了Ad-OSM腺病毒表达载体,感染OSM基因可明显抑制A375人黑色素瘤细胞的生长,诱导其凋亡。
  • 摘要:目的:重组人干扰素ω喷雾剂治疗季节性变应性鼻炎进行有效性和安全性评价。方法:随机、双盲、安慰剂对照评价重组人干扰素ω喷雾剂治疗季节性变应性鼻炎,共24例,治疗组、对照组各12例,每名患者每日早晚喷雾2次,每次每鼻孔1喷,100μl/喷,疗程14天,分别于入组、用药后第7天、用药后第14天随访。结果:用药2周后,对照组的有效率58.33%,试验组有效率83.33%,两组间有效率的比较P=0.3707。结论:重组人干扰ω素喷雾剂治疗季节性变应性鼻炎有效,安全。
  • 摘要:新型甲型流感是2009年出现的、新型甲型H1Nl流感病毒感染后引起的急性呼吸道传染病,其发病机理与与炎性因子和抗炎因子密切相关,其中细胞因子IL-6、IL-10和IFN-γ起到重要作用;但是目前有关甲型流感中细胞因子产生和功能的研究多为体外研究或动物试验,少量的临床研究也多集中于急性期,对整个病程中细胞因子水平的变化极少涉及。为了解新型甲型流感患者从急性期到恢复期以及出院随访期的血清细胞因子浓度变化,我们收集了28例患者住院当日、入院后4天、14天、36天和48天的血清并采用流式计数法同时检测IL-6、IL-10和IFN-γ浓度。结果发现患者入院当天的血清IL-6、IL-10和IFN-γ水平最高,浓度分别达9.90pg/ml、5.75 pg/ml和2.55pg/ml(中位数,IQR分别为9.48 pg/ml、3.15 pg/mg/ml、1.93 pg/ml),显著高于基础水平和其他时间的浓度,分别是基础值的6.0、3.2和2.3倍,且三者浓度两两显著相关;升高的血清IL-6和IFN-γ浓度在入院4天后降到基础水平;而升高的血清IL-10浓度在入院4天后降到基础水平以下,随后逐渐升高,到入院后第36天恢复到基础水平。同时我们分析了患者入院日血清IL-6、IL-10和IFN-γ水平和同日血清铁浓度、病程最高体温、病程发热天数的关系,发现只有血清IL-6水平与血清铁浓度显著负相关,但是需排除血清免疫球蛋白浓度的干扰。研究表明新型甲型流感患者发病早期血清IL-6、IL-10和IFN-γ水平与疾病的发展密切相关,推测血清IL-6水平的升高是引起血清铁浓度显著下降的主要原因,但是细胞因子在新型甲型流感发病机制中具体的作用仍需深入的、大样本的进一步研究。
  • 摘要:目的:探讨抗肝纤冲剂对免疫损伤肝纤维化小鼠的治疗作用,初步阐明其作用机制。方法:将75只雌性Balb/c小鼠分为5组,每组15只:正常对照组、肝纤维化模型组。秋水仙碱治疗组,抗肝纤冲剂低剂量组、抗肝纤冲剂高剂量组;除正常组外,其余各组均采用腹腔注射猪血清的方法制备肝纤维化小鼠模型。造模的同时分别用药物对小鼠进行干预治疗7周。7周末处死小鼠,取肝脏。肝组织固定、切片、免疫荧光检测肝组织中的TGF-β、Smad2/3和Smad6/7蛋白的表达,采用Western blotting方法检测肝组织中的TGF-β和Ⅰ型胶原蛋白的表达情况。结果:正常小鼠肝组织中的TGF-β、Smad2/3和Ⅰ型胶原蛋白的表达量少,Smad6/7表达量多;模型组小鼠的肝组织中TGF-β、Smad2/3和Ⅰ型胶原蛋白的表达量明显增加,而Smad6/7表达量减少:抗肝纤冲剂干预治疗后,肝组织中TGF-β、Smad2/3和Ⅰ型胶原蛋白的表达量有减少的趋势,而Smad6/7表达量又趋增加。结论:抗肝纤冲剂通过抑制TGF-β的分泌,降低Smad2/3的磷酸化水平,达到抑制Ⅰ型胶原的蛋白分泌的作用。
  • 摘要:目的:研究重组人α干扰素(rhIFN-α)以及联合应用化疗药物对骨肉瘤细胞(MG-63)凋亡和侵袭能力的影响。方法:将不同剂量rhIFN-α以及顺铂分别作用于MG-63细胞,采用MTT法检测MG-63细胞增殖抑制情况,采用Hoechest33258染色、透射电镜、流式细胞仪检测MG-63细胞凋亡率,用Transwell小室测定MG-63细胞对细胞外基质的侵袭力。结果:Hoechest 33258染色和透射电镜法发现与对照组相比,10000IU/ml rhIFN-α组、单独应用顺铂组和顺铂联合应用rhIFN-α组均出现典型凋亡特征。MTT和流式细胞仪检测结果发现:与对照组相比,100IU/mlrhlFN-α组未出现明显的细胞凋亡情况(P>0.05);10000IU/ml rhIFN-α组细胞凋亡情况较明显,凋亡率达到32.12±0.34%(P<0.05);单独应用顺铂组细胞凋亡率达到25.35±0.46%(P<0.05):顺铂联合应用rhIFN-α组对细胞凋亡率最高(P<0.05)。Transwell小室测定MG-63细胞侵袭力结果表明:与对照组相比,rhIFN-α均可显著降低MG-63细胞的体外侵袭能力(P<0.05)。结论:rhIFN-α对MG-63细胞的增殖抑制效应具有剂量依赖性特点,低剂量rhIFN-α诱导MG-63细胞凋亡不明显,10000IU/ml rhIFN-α能明显诱导MG-63细胞凋亡,而且不同剂量rhIFN-α均能促进MG-63细胞对顺铂的敏感性。体外侵袭实验表明不同剂量rhIFN-α均可抑制MG-63细胞的侵袭转移。
  • 摘要:目的:研究用polyA-promoter构建的人肿瘤生长抑制因子4(ING4)和白细胞介素24(IL-24)双基因共表达腺病毒载体Ad-ING4-polyA-promoter-IL-24(简称Ad-ING4-IL-24)对人SPC-Al肺腺癌细胞体内外放疗的增敏作用及潜在的作用机制。方法:将Ad-ING4-IL-24感染SPC-Al细胞,用RT-PCR法及Westem blotting法检测IL-24或/和ING4在SPC-A1细胞中的转录和表达;MTT法和流式细胞仪(FCM)检测PBS组、AdV(空病毒)组、Ad-ING4-IL-24、放疗及Ad-ING4-IL-24加放疗组(联合组)对SPC-Al肺癌细胞的生长抑制作用和凋亡率。采用SPC-Al细胞株建立人肺腺癌裸鼠模型,然后按上述各组进行瘤体内局部注射干预用药,动态测量肿瘤体积,并计算瘤重抑瘤率和Q值:免疫组化检测bax、bcl-2、Survivin、VEGF等基因的表达。结果:Ad-ING4-IL-24作用SPC-Al细胞后,RT-PCR、Westernblotting结果显示目的基因在SPC-AI细胞中成功转录及表达,MIT法和FCM法检测结果示联合组对SPC-Al肺癌细胞的生长抑制率和细胞凋亡率均明显高于Ad-ING4-IL-24组和放疗组(P<0.05),具有放疗增敏协同作用(Q=1.16)。体内联合组能显著抑制肿瘤生长,瘤重抑瘤率达79.2%,具放疗增敏协同效应(Q值=1.20),免疫组化结果示联合组能明显上调bax、Caspase-3等基因表达,和下调bcl-2、Survivin、VEGF等基因的表达。结论:本研究结果显示Ad-ING4-IL-24具有放疗增敏的作用,是理想的放疗增敏剂,该作用机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡和抑制血管形成有关。
  • 摘要:目的:研究腺病毒介导的ING4和IL24双基因共表达对SPC-Al肺腺癌细胞及其裸鼠移植瘤的抑癌增效作用及分子机制。方法:以50MOI各重组腺病毒分别感染SPC-Al细胞,Western blot法鉴定ING4和/或IL24基因在SPC-Al细胞中的表达:MTT法检测各重组腺病毒对SPC-A1细胞的生长抑制作用;经Annexin-V-PE/7-AAD染色后流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率变化;RT-PCR检测SPC-Al细胞中Bax、Caspase-3、Bcl-2、Survivin等因子的表达,Western blot法检测其中Cleaved Caspase-3因子的表达。动物实验中,各重组腺病毒注入裸鼠瘤体内进行抗肿瘤实验,观察各组瘤体体积变化;治疗15d后处死裸鼠、摘取瘤体并称瘤体质量;免疫组化检测瘤体组织中Bax、Caspase-3、Bcl-2、Survivin等相关因子的表达。结果:ING4和/或IL24基因在SPC-A1细胞中能够有效表达;Ad-ING4-IL24组对SPC-A1细胞的生长抑制作用优于Ad-IL24、Ad-ING4单基因组(P<0.01),呈现抑癌增效相加作用(Q=0.93);Ad-ING4-IL24组对SPC-A1细胞的细胞凋亡率明显高于Ad-IL24、Ad-ING4单基因组(P
  • 摘要:目的:建立ELISA检测卡那霉素残留量的方法并进行方法学验证,用于重组技术产品的质量控制。方法:采用间接竞争ELISA方法,样本中残留的卡那霉素将和微孔板上预包被的偶联抗原竞争抗卡那霉素抗体,加入酶标二抗后,用3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)底物显色,样本吸光值与残留卡那霉素的含量成负相关,用酶标仪进行检测并用SOFT MAX分析软件进行分析。结果:ELISA方法测定卡那霉素残留量在0.5~40.5ng/ml范围内线性良好,且符合且符合四参数方程式:y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D,r2≥0.99;板内变异小于15%,板间变异小于20%,实验重复性好,加标回收率在80%~120%之间:该方法检测与庆大霉素、盐酸四环素、链霉素和氨苄西林药物未显示交叉反应。应用该法对1批重组睫状神经生长因子(CNTF)原液的卡那霉素残留量进行测定,结果表明,每人用剂量CNTF(100μg)卡那霉素残留量小于0.5ng。结论:该方法具有灵敏度高、操作简便、检测迅速等特点,可用于重组技术产品中卡那霉素残留量的检定。
  • 摘要:目的:研究建立肿瘤溶瘤基因治疗产品——重组复制型溶瘤单纯疱疹病毒GM-CSF的检测方法与质控标准。方法:采用限制性内切酶酶切与PCR法结合,对重组病毒载体携带的GM-CSF基因、以及ICP 34.5、ICP6、ICP47等单纯疱疹病毒基因改造结构进行鉴定。A260紫外吸收法检测病毒颗粒数;pfu法测定重组病毒感染活性。重组病毒体外感染人乳腺癌肿瘤细胞MCF-7后,以ELISA法和TF-1细胞特异增殖法分别测定感染上清中GM-CSF表达量以及表达产物的生物学活性;体外感染人乳腺癌肿瘤细胞MCF-7后,测定该重组病毒对肿瘤细胞的杀伤活性;重组病毒分别以相同MOI感染人乳腺癌肿瘤细胞MCF-7与二倍体人胚肺成纤维细胞MRC-5后,分别测定感染上清中子代病毒的感染活性,并以子代病毒的感染活性比值来分析该制品在肿瘤细胞中的复制增殖特异性。采用PCR法控制野生型单纯疱疹病毒等外源病毒的残留。结果:对重组复制型溶瘤单纯疱疹病毒GM-CSF基因组的酶切、以及对所携带的GM.CSF基因、ICP 34.5、ICP6、ICP47基因改造的PCR.鉴定结果与理论值相符。病毒载体颗粒数为4.5×1010VP/ml,感染活性分别为4.3×10Tpfu/ml。重组病毒以MOI 0.01感染MCF-7细胞72h后,ELISA检测上清中GM-CSF表达量为228n/ml,以上述条件感染MCF-7细胞72h后,表达产物GM-CSF的生物学活为4.3×103IU/ml。该基因治疗制剂对人乳腺癌肿瘤细胞MCF-7体外杀伤的MOIic50为0.08。以相同MOI感染并经pfu法检测,重组病毒在人乳腺癌肿瘤细胞MCF-7与人胚肺成纤维二倍体细胞MRC-5的增殖比值为308。未检出野生单纯疱疹病毒,PCR灵敏度为10copy。其他各项指标均符合《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》及2005版《中国药典》(三部)要求。结论:初步建立了重组复制型溶瘤单纯疱疹病毒GM-CSF(HSV-I/GM-CSF)的的质量控制方法与质量标准,并已用于该制品的质量控制,同时也为其他溶瘤肿瘤基因治疗病毒载体的质量控制奠定了基础。
  • 摘要:目的:建立转hLIF基因腺病毒载体的饲养层细胞,观察对CD34+造血干/祖细胞的扩增作用及归巢能力的影响,并探讨LIF因子在信号通路方面发挥作用的分子机制。方法:建立转hLIF基因腺病毒载体的饲养层细胞,并用RT-PCR法鉴定目的基因;采用免疫磁珠法分离脐带血CD34+造血干/祖细胞,流式细胞术检测纯度;将CD34+造血干/祖细胞与饲养层细胞共培养,流式细胞术检测各组增殖效果;用LIF因子激活的JAK/STAT信号通路的阻断剂AG490作用于共培养的各组细胞,流式细胞术检测阻断后各组的增殖效果。结果:建立的转基因饲养层细胞均有绿色荧光,RT-PCR法证实有目的基因表达,免疫磁珠法分离的脐血CD34+造血干/祖细胞纯度可达92.9±4.51%,与饲养层细胞共培养7d后CD34+造血干,祖细胞可扩增16.51倍,培养后的细胞用Transwell板做体外迁移实验,与转基因饲养层细胞共培养的干细胞,其诱导迁移率为40.76±1.69%,明显高于对照组,可以较好的保持其归巢能力。AG490阻断后干细胞的增殖能力明显下降。结论:建立的转hLIF基因腺病毒载体饲养层细胞可以有效的扩增脐血CD34+造血干/祖细胞,延缓其分化,并且体外扩增后仍保持较高的归巢能力,LIF因子通过激活JAK/STAT信号通路维持造血干/祖细胞的增殖和归巢能力。
  • 摘要:目的:探讨粒细胞集落刺激因子(granulocyte-colonystimulating factor,G-CSF)促进肝大部切除小鼠肝再生的作用。方法:建立小鼠肝大部分切除(约70%)模型,将肝切除小鼠随机分为三组,单纯肝切除组:肝切除后24h,腹腔注射生理盐水5 d;G-CSF+肝切除组:rhG-CSFl50μg·kg-1·d-1腹腔注射5d,第6天进行肝切除;肝切除+G-CSF组:肝切除术后24h,rhG-CSF 150μg·kg-1·d-1腹腔注射5d.于术后7d取血清和肝脏,检测血清生化指标,并采用免疫组织化学方法观察肝内的增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达及BrdU阳性细胞。结果:肝切除+G-CSF组和G-CSF+肝切除组BrdU表达及PCNA阳性细胞明显升高,与对照组比较差异均具有统计学意义(74.08%±8.86%,68.91%±9.64%vs 57.36%±13.37%,均PPCNA<0.05);肝组织病理检查发现G-CSF+肝切除组27%(3/11)小鼠肝组织出现了不同程度的炎症反应,肝功生化学也显示血浆ALT及AST升高,且其差异有统计学意义(均PPCNA<0.05)。结论:粒细胞集落刺激因子(G-CSF)具有明显促进肝大部切除小鼠肝再生的作用,但也容易诱发肝脏炎症反应。
  • 摘要:目的:研究bFGF单克隆抗体抑制黑色素瘤B16细胞凋亡的作用机制。方法:实验室自制bFGF单克隆抗体,经Protein G纯化后干预黑色素瘤B16细胞,CCK-8法检测其对B16细胞的增殖抑制,DAPI染色检测细胞凋亡形态,Annexin V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blot检测AKT和Caspase3的表达。结果:bFGF单克隆抑制黑色素瘤B16细胞增殖,2001μg/ml作用72h后,细胞抑制率可达(36±2.8)%;B16细胞有明显的凋亡形态出现,凋亡率提高(p<0.01);磷酸化蛋白AKT和pro-Caspase3表达均降低(p<0.05)。结论:bFGF单克隆抗体可诱导黑色素瘤B16细胞凋亡,发现其与AKT通路的抑制及Caspase3活化有关。
  • 摘要:肝癌是最为常见的人类恶性肿瘤之一,尤其在亚非人群之中,肝癌发病率很高。临床研究显示,肝癌对放化疗不敏感,迄今为止,人类对肝癌仍然没有理想有效的治疗手段。此外,有越来越多的实验证据表明,肝癌在一定程度上是一种激素依赖的癌症。通过分子克隆的方法构建miR-26a肿瘤特异性表达质粒,检测其在肿瘤细胞和正常细胞中的表达量差异,应用流式细胞仪,cck-8试剂盒,裸鼠皮下成瘤实验检测特异性表达质粒的抑癌效果,并且引入双荧光素酶报告基因实验探索miR-26a的未知靶基因。首次证实ERα是miR-26a的一个直接靶基因,高表达miR-26a可以有效抵制E2(Estradiol)对肝癌细胞的促增殖作用。hAFP与hTERT双启动子介导miR-26a特异性表达可以为肝癌基因治疗提供新的方法与思路。
  • 摘要:目的:观察骨髓干细胞是否具有促进肝大部切除大鼠肝再生作用。方法:建立大鼠肝大部切除(约70%)模型,将肝切除大鼠随机分为四组,肝切除组:15只,只行肝大部切除;G-CSF组:15只,肝切除术后1d,rhG-CSF 150μg·kg-1·d-1腹腔注射5d;;MSCs组:15只,肝大部切除后1d,将1.5mL含1.5×106左右的MSCs悬液从大鼠尾静脉缓慢注入:G-CSF+MSCs组:14只,肝切除术后1d,将1.5mL,含1.5×106左右的MSCs悬液从大鼠尾静脉缓慢注入,并给予rhG-CSF 150μg·kg-1·d-1腹腔注射5d。分别于术后3天、9天取血清检测肝功能,术后9天处死大鼠取肝脏标本,免疫组织化学方法观察肝内Ki-67的表达及BrdU阳性细胞,并通过流式细胞仪检测G-CSF动员后大鼠外周血CD34+细胞。结果:三组干预组术后9天肝功能显示ALB升高,且其差异有统计学意义(P☆=0.001,P◇=0.007,P#=0.031);三组干预组肝细胞Ki-67表达(110.16±27.64、103.57±33.90、98.52±21.87vs72.39±27.04个细胞MOO倍视野)及BrdU阳性细胞(17.96±5.57、16.45±5.75、16.66±5.11 vs 11.72±3.83个细胞1400倍视野)均高于对照组,且差异具有统计学意义(P@=0.003,P§=0.009)。结论:通过G-CSF动员HSCs或直接输注MSCs,均可促进肝再生,而二者共同干预未能增强促进肝再生作用。
  • 摘要:目的:本文旨在探讨bFGF单克隆抗体对C57 BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤生长、转移及血管新生的抑制作用。方法:采用皮下接种肿瘤细胞建立Lewis肺癌自发转移模型,随机分为PBS组、bFGF单克隆抗体MabF7治疗组、正常小鼠IgG阴性对照组。自接种第9天开始给药,每三天一次,连续6次。同时观察Lewis肺癌小鼠健康状况,游标卡尺测量皮下移植瘤体积,给药六次后处死小鼠,称瘤重,计数各组小鼠肺表面转移瘤结节数,免疫组化法检测肿瘤组织微血管密度(microvessel density,MVD)。结果:MabF7治疗组小鼠肿瘤体积与PBS组相比生长缓慢,小鼠瘤重为2.64±1.04 g与PBS组的5.10±1.32 g相比显著降低(P<0.05);MabF7组小鼠肺表面转移瘤结节数为3.00±2.09个显著低于PBS组的12.29±2.37个(P<0.05)。另外MabF7组可显著抑制肿瘤组织MVD。结论:bFGF单抗可明显抑制C57BL/6小鼠Lewis肺癌生长及转移,其作用与抑制肿瘤增殖及微血管生成相关。
  • 摘要:目的:研究用PolyA-Promoter构建的人肿瘤生长抑制因子4(ING4)和自细胞介素24(IL-24)双基因共表达腺病毒载体Ad-ING4-PolyA-Pmmoter-IL-24(简称Ad-ING4-IL-24)对人乳腺癌放疗的增敏作用及相关作用机制。方法:将Ad-ING4-IL-24腺病毒感染人乳腺癌MDA-MB-231细胞,用Western blot法检测ING4和IL-24基因在肿瘤细胞中的表达;MTT法和流式细胞仪(FCM)检测Ad-ING4-IL24,放疗及Ad-ING4-IL-24加放疗组(联合组)对MDA-MB-231乳腺癌细胞的生长抑制作用、凋亡率和细胞周期分布;RT-PCR检测凋亡相关基因的转录;在乳腺癌的裸鼠移植瘤动物模型上,检测Ad-ING4-IL-24联合放疗对移植瘤生长的抑制作用。结果:ING4和IL-24基因可在MDA-MB-231细胞中成功表达,并对乳腺癌细胞增殖有明显抑制作用,并能引起细胞周期中G2/M期阻滞及细胞凋亡,其中联合组抑制细胞生长及促凋亡作用明显优于对照组(P<0.05)。其凋亡机制可能与Bax、Caspase-3升高、Bcl-2降低有关;体内联合组能显著抑制肿瘤生长,瘤重抑瘤率达88.1%,具有放疗增敏相加效应。结论:Ad-ING4-IL-24能够明显抑制人乳腺癌细胞的生长,并明显提高其对放射线的敏感性。该作用机制可能与Ad-ING4-24引起G2/M期阻滞,诱导肿瘤细胞凋亡有关。
  • 摘要:本文阐述了干扰素、白介素、集落刺激因子等细胞因子在动物传染性疾病预防和治疗领域的应用现状与前景,同时指出了人与动物细胞因子的种属特异性及通用性,用于人类疾病治疗的细胞因子及基因重组药物用于低等动物疾病的防治,无疑会取的事半功倍的效果。
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