RNA干扰抑制PARp-1对卵巢癌SKOV3细胞EMT的逆转及顺铂敏感性的影响研究

摘要

本项目拟通过建立PARP-1基因转染稳定表达的卵巢癌SKOV3细胞株，对其生物学特性进行体外研究，观察其对侵袭及EMT的影响;通过体外实验观察RNA干扰抑制PARP-1后对顺铂敏感性的影响;通过建立裸鼠卵巢癌模型，通过体内实验，观察RNA干扰抑制PARP-1后对顺铂敏感性的影响;为卵巢癌的靶向治疗提供理论及实验依据。
　　本文主要分三部分展开研究：
　　第一部分: RNA干扰抑制PARP-1对卵巢癌SKOV3细胞EMT的逆转研究
　　目的:
　　1．建立PARP-1基因转染稳定表达的卵巢癌SKOV3细胞株。
　　2．探讨干扰抑制PARP-1基因对卵巢癌SKOV3细胞侵袭的影响。
　　3．探讨干扰抑制PARP-1基因对卵巢癌SKOV3细胞上皮间质转化的逆转作用。
　　方法:
　　1．细胞的转染及稳定转染细胞株的筛选（PCR和Western-blot）。
　　2．Transwell小室法侵袭实验，检测干扰抑制PARP-1对SKOV3细胞侵袭能力的影响。
　　3．Western-blot检测干扰抑制PARP-1后对E-cadherin和Vimentin表达的影响。
　　结果:
　　1．SKOV3细胞的转染效率在90％以上。
　　2．转染后PARP-1 mRNA的表达明显降低，PARP-1siRNA1下降了38％，差异具有显著性(P＜0.05);而PARP-1 SiRNA2下降了81％，差异具有显著性(P＜0.01)。
　　3．转染后PARP-1蛋白的表达明显降低，PARP-1siRNA1下降了12％，(P＜0.05);而PARP-1SiRNA2下降了44％，与其它三组相比，(P＜0.01)。转染后PARP-1 SiRNA2组蛋白表达水平最低，与RT-PCR检测结果相符。
　　4．PARP-1 SiRNA转染组侵袭细胞数目明显减少(P＜0.05)，而未转染组和NcSiRNA组之间比较，侵袭细胞数目无统计学差异(P＞0.05)。
　　5．PARP-1 SiRNA转染组E-cadherin的表达明显升高(P＜0.05)，而未转染组和NcSiRNA组之间E-cadherin的表达比较无明显差异(P＞0.05)。与未转染组、NcSiRNA组相比，PARP-1 SiRNA转染组Vimentin的表达显著降低(P＜0.05)，而未转染组、NcSiRNA组中Vimentin的表达无明显差异(P＞0.05)。
　　结论:
　　1．干扰抑制PARP-1，能明显的降低卵巢癌SKOV3细胞的侵袭。
　　2．干扰抑制PARP-1，能使EMT发生逆转。
　　3．PARP-1蛋白的表达可能与卵巢癌侵袭和EMT的发生有关。
　　第二部分: RNA干扰抑制PARP-1对顺铂敏感性影响的体外研究
　　目的:
　　1．探讨PARP-1受到干扰抑制，对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响。
　　2．探讨PARP-1受到干扰抑制，顺铂对SKOV3细胞增殖的影响。
　　3．探讨PARP-1受到干扰抑制，顺铂对SKOV3细胞凋亡、细胞周期及ERK1/2信号通路的作用。
　　方法:
　　1．细胞集落实验观察干扰抑制PARP-1，细胞集落的变化。
　　2．通过CCK8法观察不同浓度下顺铂对SKOV3细胞细胞活性的影响。
　　3．通过流式细胞术和Hoechst33258染色观察干扰抑制PARP-1，SKOV3细胞凋亡的变化，通过流式细胞术检测细胞周期的变化，Western-blot检测干扰抑制PARP-1后对ERK信号通路表达的影响。
　　结果:
　　1．转染PARP-1 SiRNA后SKOV3细胞的集落形成能力受到明显抑制，细胞生长速度减慢，两组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　2．PAPR-1 SiRNA组细胞和NcSiRNA对照组细胞的细胞活性均随顺铂浓度的增高而逐渐降低。细胞活性随着顺铂的治疗呈剂量依赖性，下调PARP-1的表达，在顺铂的作用下，细胞活性明显降低。两者的差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　3．PAPR-1 SiRNA组细胞经顺铂处理后凋亡细胞的细胞形态发生改变，NcSiRNA组细胞核经染色后，细胞核染色略淡且分布均匀，PARP-1 SiRNA组中凋亡细胞的数量较前增多，经与顺铂联用后荧光显微镜下可看到细胞核呈浓染蓝光、表现为细胞固缩的特征，且凋亡细胞的数量明显增多。PAPR-1 SiRNA组和NcSiRNA对照组相比，两者的差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　4．单纯的PARP-1干扰后对细胞周期的影响不明显。而干扰抑制PARP-1后，顺铂作用48小时后，细胞周期呈明显的G0/G1期阻滞，同时S期与G2/M期细胞分布减少。
　　5．顺铂抑制了ERK的磷酸化，而干扰抑制了PAPR-1的表达后，pERK1/2表达更低，但总的ERK1/2表达未受影响。说明干扰抑制PAPR-1的表达后，能增强顺铂对ERK1/2信号通路的抑制作用。
　　6．U0126是ERK特异性抑制剂，我们先用10uM的U0126作用于细胞2h，然后加入10uM顺铂，发现当我们阻断ERK1/2信号通路后，PAPR-1SiRNA组细胞活性明显降低，以上结果表明，U0126作用后能有效增强PAPR-1 SiRNA介导的SKOV3细胞对顺铂的敏感性。
　　结论:
　　1．干扰抑制PARP-1的表达，能使SKOV3细胞的增殖能力下降。
　　2．干扰抑制PARP-1的表达，能使顺铂对SKOV3细胞的毒性增强，降低SKOV3细胞的细胞活性，能在一定程度上降低顺铂对SKOV3细胞的耐药性。
　　3．转染小干扰RNA后，PAPR-1SiRNA能使SKOV3细胞的细胞形态发生改变，凋亡比例上升，在顺铂的作用下，凋亡细胞数目明显增多，干扰抑制PAPR-1能增强顺铂对SKOV3细胞的促凋亡作用。
　　第三部分:RNA干扰抑制PARP-1顺铂敏感性影响的体内研究
　　目的:
　　1．建立卵巢癌的裸鼠模型。
　　2．探讨裸鼠抑制PARP-1 SiRNA对顺铂化疗敏感性的影响。
　　3．探讨卵巢癌裸鼠瘤PARP-1受到干扰抑制后顺铂对卵巢癌增殖的影响。
　　方法:
　　将每只裸鼠一侧协腹部皮下注入浓度为1×107个/ml卵巢癌SKOV3细胞100ul，成功建立卵巢癌裸鼠模型，当裸鼠移植瘤直径不小于5mm时，将20只瘤鼠随机分成空白对照组、单纯顺铂组、顺铂+NcSiRNA组、顺铂+PARP-1SiRNA组，每组5只裸鼠。空白对照组:给予腹腔注射100μl生理盐水，隔72h1次，共3次;单纯顺铂组:给予腹腔注射顺铂2mg/kg，隔72h1次，共3次;顺铂+NcSiRNA组:每次腹腔注射顺铂的同时，注入慢病毒阴性载体NcSiRNA(病毒含量1×109pfu)0.1 ml;顺铂+PARP-1SiRNA组:每次腹腔注射顺铂的同时，注入慢病毒PARP-1 SiRNA(病毒含量1×109pfu)0.1 ml。每3天测量移植瘤1次，计算肿瘤体积和重量;观察RNA干扰PARP-1后及顺铂干预治疗后对移植瘤瘤体的影响;利用免疫组化检测增殖指标Ki67在各个分组中的表达，观察顺铂作用后细胞的增殖情况。
　　结果:
　　1．裸鼠接种卵巢癌SKOV3细胞后，反应正常，处于潜伏期生长的肿瘤一般在2周左右，连续观察肿瘤形态，早期肿瘤包块形态稍规则，后期包块形态欠规则，质地稍硬，与周围边界欠清（图1）。4周后处死裸鼠，立即将病灶切除，制作病理切片，HE染色，观察卵巢癌裸鼠细胞的镜下特点（图2），可见卵巢癌细胞大小不一，形状不一，细胞核较大，间质水肿，细胞异型性明显，证实成功建立卵巢癌裸鼠瘤模型。
　　2．为研究PARP-1SiRNA组化疗后对已形成的裸鼠卵巢癌移植瘤的生长的作用，我们通过建立起裸鼠皮下移植瘤模型，对照组给予腹腔注射生理盐水，在移植瘤内注射PARP-1SiRNA病毒和NcSiRNA病毒，同时腹腔给予顺铂，发现注射PARP-1 SiRNA病毒生长速度较NcSiRNA病毒减慢，且肿瘤的体积缩小。28天后空白对照组裸鼠抑制瘤的平均体积是576mm3，单纯顺铂处理组的体积是339mm3，顺铂+NcSiRNA处理组裸鼠抑制瘤的平均体积为341mm3;而顺铂+PARP-1SiRNA组裸鼠移植瘤的平均体积为213mm3。空白对照组移植瘤的肿瘤为1.0g，顺铂+NcSiRNA组和单纯顺铂组裸鼠移植瘤的平均重量分别为0.57g、0.56g;而顺铂+PARP-1SiRNA组移植瘤的平均重量为0.21g。顺铂+PARP-1SiRNA组在肿瘤体积和肿瘤的重量与其它三组比较，差异有显著性(P＜0.05)。单纯顺铂组、顺铂+NcSiRNA组裸鼠移植瘤的平均抑瘤率分别是33.6％，32.3％，而顺铂+PARP-1SiRNA组裸鼠移植瘤的平均抑瘤率是59.4％，与前两组相比，差异有显著性(P＜0.05)。
　　3．免疫组化示:经治疗后，PARP-1SiRNA化疗组移植瘤组织中Ki67蛋白的表达明显降低。
　　结论:RNA干扰抑制PARP-1在体内能够显著提高卵巢癌顺铂化疗的敏感性。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分：RNA干扰抑制PARP-1对卵巢癌SKOV3细胞EMT的逆转

前言

材料与方法

结果

讨论

附图

参考文献

第二部分 RNA干扰抑制PARP-1对顺铂敏感性影响的体外研究

前言

材料与方法

结果

讨论

附图

附表

参考文献

第三部分 RNA干扰抑制PARP-1对顺铂敏感性影响的体内研究

前言

材料与方法

结果

讨论

附图

附表

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

英文论文1

英文论文2