Il-27、Th1及Th17细胞在MS中的表达及其作用机制研究

摘要

背景：多发性硬化(Multiple sclerosis，MS)是一种自身免疫性疾病，病理特点为炎性侵润的淋巴细胞和巨噬细胞造成中枢神经系统脱髓鞘，该病的病变部位位于脑或脊髓。根据临床病程不同，主要分为复发缓解型MS(RR-MS)、原发进展型MS(PP-MS)和继发进展型MS(SP-MS)等临床亚型。其中约85％的患者为复发缓解型，这其中30％～40％的患者于5～8年内进展为继发进展型;另外10％～15％的患者为原发进展型。多发性硬化的临床症状是由于中枢神经系统髓鞘脱失所造成。但是MS病因和发病机制至今仍未完全明确，有研究表明，多发性硬化的发病原因是因为自身免疫性T淋巴细胞进入中枢神经系统，而疾病的进展可能与免疫调节失衡有关;另外一个有关因素是异位的脑膜B细胞，B细胞异常活化，释放细胞因子，吸引免疫细胞在中枢神经系统聚集，并引发皮层脱髓鞘以及轴突和神经元的损伤，最终导致多发性硬化。二十世纪中期，人们通过对自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)的研究，发现Th1、Th17细胞和抗原提呈细胞对中枢神经系统损伤;中枢神经系统自身抗原的主动免疫和髓鞘碱性蛋白(Myelin basic protein，MBP)特异性T细胞的被动转移诱导了EAE的产生。近来的研究进一步证明MS的发病机制远比想象的要复杂:众所周知，Ⅰ型辅助性T细胞(Th1)起重要作用，但其他免疫细胞（包括B细胞、CD8+T细胞和自然杀伤性T细胞等）也能通过诱导或调控MS患者中枢神经系统内的免疫应答过程而参与其发病过程。白介素-27(interleukin-27，IL-27)于2002年发现，是IL-12家族的一种细胞因子，由EB病毒诱导蛋白3(EBV induced protein3，EB3)和P28两个亚基组成异源二聚体。IL-27不但对早期Th1细胞分化起作用，而且还可以抑制Th1，Th2和Th17细胞的免疫应答;在T细胞增殖分化早期，IL-27促进CD4+T细胞向Th1方向分化，另外IL-27可协同IL-2促进初始T细胞产生IFN--γ，同时促进单核细胞产生IL-1、12、18和INF-γ等炎症细胞因子;IL-27还可以抑制辅助性Th17细胞和诱导型调节性T细胞的发育;IL-27可诱导小鼠B细胞产生IgG2a，抑制IL-4诱导的IgGl的合成。通过对EAE的研究，证实IL-27通过抑制Th17细胞的反应而对中枢神经系统起到保护作用，最近的研究表明，IL-27可能通过诱导调节性T细胞产生IL-10发挥调节作用，IL-27可通过STAT1信号转导途径抑制Th17细胞分化，从而达到抑制炎症的作用。此外，IL-27也可抑制调节性T细胞的分化增殖，直接减少细胞因子IL-12、IL-17、IL-23等分泌。研究证实:在风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，RA)、特发性免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia，ITP)等自身免疫性疾病中，往往可以发现IL-27的表达水平下调，故IL-27在自身免疫性疾病的发病及进展过程中发挥着重要作用。Th17细胞是最近发现的细胞谱系，Th17细胞能分泌炎性介质IL-17，在自身免疫性疾病发生和发展中起着关键作用。之前人们认为EAE是由IL-12诱导的Th1细胞所介导的。通过阻断IL-12通路，可以明显改善EAE的症状。IL-12是一个包含p40和p35两个亚单位的异二聚体，研究发现IL-12p35缺陷的小鼠对EAE发病是敏感的，而IL-12p40缺陷的小鼠对发病产生抵抗。IL-23与IL-12共享IL-12p40亚单位，独立拥有p19亚单位。研究发现IL-23p19及IL-12p40两个亚单位可以诱导EAE发病，而IL-12p35难以诱导EAE发病。在研究IL-23在EAE和CIA作用机制过程中，发现缺乏IL-23将无法诱导Th17细胞分化增殖。相关报道证实:在多发性硬化患者大脑病灶IL-17 mRNA表达是增加的;和正常脑白质相比，Th17细胞促进因子RORe，IL-17D，IL-26，IL-12R表达增加，而Th17细胞抑制因子IL-4，IFN-γ，IL-10，IL-5和IL-13表达减少;早期研究还发现，多发性硬化患者血液和脑脊液单核细胞IL-17基因表达较健康对照组高，而且进展型多发性硬化患者进展期的IL-17基因表达IL-17基因表达更高。在组织中，Th17细胞刺激生成各种炎性细胞因子、趋化因子、基质金属蛋白酶以及其它炎性介质，促进炎性细胞及T细胞聚集;最近一项研究报道，进展型多发性硬化患者外周血单个核细胞中Th17细胞的比例是健康对照组的7倍。所有这些都说明Th17细胞在多发性硬化发病过程中起重要作用。Th17细胞在分化上不同于Th1和Th2细胞。初始CD4+T细胞在IFN-γ的诱导下分化为Th1细胞，在IL-4的诱导下分化为Th2细胞。研究显示初始CD4+T细胞在转化生长凶子13和IL-6的共同诱导下分化为Th17细胞，IL-21作为自分泌因子则促进Th17细胞的分化。我们知道，CD4+T细胞的分化需要特殊转录因子的参与，Th1细胞的分化需要转录因子STAT1、STAT4、T-bet，而Th2细胞需要STAT6等，已发现一些转录因子在Th17细胞分化中发挥作用，比如维甲酸相关孤核受体γt(retinoicacid-related orphannuclear receptorγt，RORγt)，与人类Th17细胞表达的特异性转录因子RORC同源，是控制Th17细胞分化的关键的转录因子。它能转导小鼠初始T细胞诱导IL-17生产发挥致炎作用。由于TGF-B和IL-6刺激CD4+Th细胞表达RORγt。RORγt缺乏小鼠通过减少IL-17的分泌，减少细胞毒性作用，但是在人类最近的研究报道，虽然TGF-B促进RORC表达，但TGF-B不能诱导Th-17细胞分化，表明人类RORC和IL-17的表达无直接关系。白介素-17是Th17细胞最主要的效应性细胞因子。IL-17通常指IL-17A，是IL-17家族中的一员。IL-17家族包括6个成员的配体(IL-17A～IL-17F)。报道显示:对进展型多发性硬化患者脑活检，显示活动性疾病患者较静止期患者活化Th17细胞增加，IL-17分泌增多，表明IL-17在炎症反应中起重要作用，而且白介素-17在其它自身免疫性疾病的发病机制中也起一定的作用，被认为是致病因素之一。比如在风湿性关节炎，特发性免疫性血小板减少症中，IL-17都发挥着它的致病作用。IL-17不仅诱导CCL2、IL-6和IL-8的分泌，还可以触发血脑屏障内皮细胞形成活化产物;这些活化产物进一步诱导小胶质细胞分泌IL-6、CXCL2，诱导少突胶质细胞分泌IL-6，IL-1和一氧化氮等炎性产物，诱导中性粒细胞聚集，增强炎症反应;IL-17通可收缩血脑屏障内皮细胞，中断紧密连接蛋白的表达，介导其它炎性因子通过血脑屏障，造成神经损伤;IL-17协同TNF-α作用，增强不同的上皮和内皮细胞分泌P-选择素、E-选择素、CXCL1、CXCL2、CXCL5、GM-CSF和G-CSF，增加氧化应激诱导少突胶质细胞凋亡。IL-17是MS动物模型实验性自身免疫性腑脊髓炎EAE的重要效应因子，实验证实:将EAE小鼠IL-17基因敲除，所造成的EAE神经损伤程度降低;且给予抗IL-17中和性抗体注射，可以降低甚至延缓EAE的发生。由此一种新观点认为，在EAE中起核心作用的是IL-17诱导产生的以分泌IL-17、IL-17F、IL-6等促炎症细胞冈子为特征的Th17细胞。作为自身免疫性疾病中的一种，多发性硬化呈现T细胞亚群失衡，造成免疫反应损伤神经，IL-27与Th1、Th17细胞分化增殖密切相关，所以我们对IL-27与MS中T细胞亚群失衡进行相关性的研究。通过测定进展型MS患者及健康对照血浆IFN-γ、IL-4、IL-17、1L-27水平、外周血Th1、Th17细胞亚群表达水平，来探讨IL-27在进展型MS患者中Th1、Th17细胞失衡的作用机制。
　　目的：检测进展型MS病人及健康对照血浆IL-27，IFN-γ,IL-17表达水平;检测外周血单核细胞IL-27，IFN-γ，T-bet,IL-17，RORγtmRNA表达及Th1、Th17细胞的表达情况，分析IL-27和血浆IFN-γ，IL-17及与外周血Th1、Th17细胞的表达相关性，探讨IL-27在多发性硬化Th细胞亚群失衡中的作用机制，进一步阐明IL-27在多发性硬化的发病中的作用，为进展型MS诊断和治疗提供帮助。
　　方法：⑴抽取45例MS患者及25例健康对照外周血，肝素抗凝，离心，留取血浆，于-80。C低温冰箱保存。⑵Ficoll-Paque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMCs)。⑶收集病人及健康对照血浆，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测MS及健康对照血浆中IL-27，IFN-γ和IL-17的水平。⑷全血抗凝，加入PMA，莫能霉素及离子霉索的刺激液，进行流式细胞仪染色法测定外周血淋巴细胞IL-17和IFN-γ的表达，从而检测外周血中Th17以及Th1细胞的表达情况。⑸实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测外周血IL-27，IFN-γ，T-bet，IL-17和RORγtmRNA表达水平。
　　结果：①ELISA结果显示:MS患者血浆IL-27水平（119.16±29.86 pg/ml）显著低于健康对照血浆IL-27水平(140.01±15.23 pg/mL, P＜0.05); MS患者血浆IFN-γ水平（143.05±7.13pg/mL）与健康对照组血浆IFN-γ水甲(40.02±5.72pg/ml)无显著差异(P=0.074，);MS患者血浆IL-17水平（33.68±9.07 pg/ml）显著高于健康对照血浆IL-17水平(20.17±4.97 pg/mL，P＜0.001，);血浆IL-27水平在继发进展型MS患者（117.5±31.36 pg/ml）、原发进展型MS患者(122.16±27.66 pg/ml）二组间无显著差异（P=0.564，）;血浆IFN-γ水平在继发进展型MS患者（42.99±7.18 pg/ml）、原发进展型MS患者（43.13±7.26 pg/ml）二组间无显著差异（P=0.949;）;血浆IL-17水平在继发进展型MS患者(34.39±8.26pg/ml)、原发进展型MS患者（32.40±10.56 pg/ml）二组间无显著差异（P=0.42;）。②MS患者血浆IL-27水平与IL-17水平之间存在负相关(r=-0.371，P=0.012，Pearson correlation analysis);MS患者血浆IL-27水平与IFN-γ水平之间无相关性(r=-0.07,P=0.649), Spearman correlation analysis)。③进展型MS患者Th1细胞的水平略高于健康对照组(11.54±3.38％vs.10.06±3.04％)，但差异无统计学意义（P=0.075）;和进展型MS患者血浆1L-17水平升高一致，Th17细胞水平显著高于健康对照组(2.01±0.58％ vs.1.33±0.36％;P＜0.001); Th1细胞的水平在继发进展型MS病人和原发进展型MS病人之间没有显著差异(11.70±3.46％ vs.11.25±3.32％，P=0.662)。同样的，Th17细胞的水平在继发进展型MS病人和原发进展型MS病人之间没有显著差异(2.02±0.56％vs.1.99±0.63，P=0.82)。④进展型MS患者血浆中的IL-27水平与其相应外周血中的Th17细胞表达水平之间呈负相关性(r=-0.301，p=0.045)。而且，MS患者血浆中的IL-27水平与其相应外周血中的Th1细胞表达水平之间未发现相关性（r=-0.164，P=0.281）。⑤RT-PCR结果示:进展型MS患者外周血单核细胞IL-27mRNA水平显著低于健康对照（0.69-fold，P＜0.001）;进展型MS患者外周血单核细胞IFN-γ，T-bet水平与正常对照组之间无显著差异(P＞0.05).;进展型MS患者外周血单核细胞IL-17mRNA水平与RORγtmRNA水平均较健康对照显著升高(4.39-fold，P＜0.001; and9.58-fold,P＜0.001)。
　　结论：⑴证实IL-27表达异常可能参与了MS发病；⑵在MS病人中，血浆IL-17及特异性转录因子RORγtmRNA的表达水平是显著升高，并且与Th17细胞在MS中表达升高呈现一致性;表明MS病人Th17细胞表达异常；⑶进展性MS患者的1L-27与血浆IL-17浓度及外周血Th17细胞表达呈负相关，提示IL-27在MS中的具有抗炎保护作用，表明IL-27可能成为MS诊断和治疗的一种新策略。本研究发现进展型MS患者血浆IL-27水平和外周血IL-27mRNA表达水平下降，并且IL17以及Th17细胞表达升高，这表明IL-27、Th17细胞在MS病理生理过程中发挥作用。此外，进展型MS患者IL-27与Th17细胞表达和血浆IL-17浓度呈负相关。表明IL-27可能对进展型MS诊断和治疗提供帮助。

目录

声明

摘要

符号说明

第Ⅰ部分 白介素-27在多发性硬化中的表达及其作用机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

第Ⅱ部分 Th1细胞与Th17细胞在多发性硬化中的表达及其作用机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

第Ⅲ部分 IL-27在多发性硬化Th亚群失衡中的作用机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

致谢

攻读博士期间发表的论文

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