心肌缺血再灌注中Rho-kinase对PI3-kinase/Akt的作用及紫檀芪的干预研究

摘要

本文从以下几部分进行论述：
　　第一部分 心肌缺血再灌注和缺血预适应中Rho-kinase对PI3-kinase/Akt的作用
　　目的：
　　本部分研究拟建立大鼠心肌缺血再灌注和缺血预适应模型，应用药物fasudil抑制Rho-kinase活性，通过检测心肌梗死面积、心肌细胞的凋亡、Rho-kinase和Akt的活性变化来阐明Rho-kinase在心脏I/R和IPC中的作用机制。
　　方法：
　　1、健康雌性Wistar大鼠随机分为4组:(1)sham group对照组:假手术组（12只）;(2)I/R组(12只):大鼠心肌缺血再灌注模型组;(3)I/R+fasudil组（12只）:建立大鼠心肌缺血再灌注模型前给予Rho-kinase抑制剂法舒地尔fasudil组;(4)IPC组（12只）:大鼠心肌缺血预适应组。
　　2、制备大鼠心肌缺血再灌注模型。
　　3、制备大鼠心肌缺血预适应模型。
　　4、检测心肌梗死面积:采用伊文思蓝染色鉴别心肌缺血危险区(AAR)和非缺血区，硝基蓝四氮唑染色鉴别梗死心肌和非梗死心肌。
　　5、TUNEL检测心肌细胞凋亡:利用末端脱氧核苷酸转移酶介导的末端标记技术(TUNEL)试剂盒检测各组大鼠心肌细胞的凋亡。
　　6、免疫组化法标记p-Akt。
　　7、Western blot检测p-Akt和Rho-kinase的活性变化。Rho-kinase的活性通过检测其特异性底物肌球蛋白磷酸酶靶亚基(MYPT-1)的磷酸化水平来表示。
　　结果：
　　1、在心肌缺血再灌注（I/R）组中p-MYPT-1（磷酸化的MYPT-1）大量表达，但在心肌缺血预适应组中， p-MYPT-1表达降低，p-Akt表达显著增高，与I/R组比较，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。Rho-kinase在I/R中活性增加，而心肌缺血预适应和fasudil可抑制Rho-kinase活性。
　　2、抑制Rho-kinase的活性可减少I/R所致的心肌细胞凋亡:I/R过程中应用fasudil抑制Rho-kinase活性可减少心肌细胞凋亡率，而对大鼠进行心肌缺血预适应也可通过抑制Rho-kinase的活性降低心肌细胞凋亡。
　　3、抑制Rho-kinase活性可减少心肌梗死面积:在I/R组中，AAR和心肌梗死面积分别是（52.62±2.73％）和（59.89±3.83％）。
　　4、抑制Rho-kinase可增加Akt活性:p-Akt在I/R组中表达被抑制，而在IPC组和I/R+fasudil组中大量表达。在I/R中应用Rho-kinase抑制剂fasudil后，p-Akt表达增加。
　　结论：
　　1、心肌缺血再灌注损伤中，Rho-kinase活性显著增加，造成心肌细胞凋亡，心肌梗死面积加大，心肌损伤加重。
　　2、抑制Rho-kinase活性可减少心肌缺血再灌注中心肌细胞凋亡率和心肌梗死面积，降低心肌细胞的损伤。
　　3、Rho-kinase可通过调节p-Akt水平影响心肌细胞凋亡。
　　4、心肌缺血预适应可减少心肌细胞凋亡和心肌梗死面积。
　　5、心肌缺血预适应中Rho-kinase活性降低，进而减轻心肌损伤，这一过程可能是通过PI3-kinase/Akt的活化介导的，本研究为临床上冠心病的治疗提供新的理论指导和参考依据。
　　第二部分 紫檀芪预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的作用研究
　　目的：
　　本部分研究拟建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，进行紫檀芪预处理，探讨紫檀芪对心肌缺血再灌注损伤的作用。
　　方法：
　　1、健康雌性Wistar大鼠随机分为4组，分别为:(1)对照组:假手术组(sham组，12只);(2)缺血再灌注心律失常模型组（I/R组，12只）;(3)紫檀芪小剂量组（12只）:造模前给予紫檀芪预处理，20mg/kg紫檀芪溶液灌胃，每天1次，共计2周;(4)紫檀芪大剂量组（12只）:造模前给予紫檀芪预处理，40mg/kg紫檀芪溶液灌胃，每天1次，共计2周。
　　2、建立大鼠心肌缺血再灌注模型。
　　3、通过心电监护，分别记录室性心律失常发生率，室性早搏(VPB)、室性心动过速(VT)发生率，并进行心律失常评分（VA评分）。
　　4、ELISA法检测各组大鼠血清中TNF-α、 IL-1β和SP的表达变化
　　5、检测大鼠心肌组织中活性氧的含量。
　　6、检测大鼠心肌组织中谷胱甘肽的活性变化。
　　7、检测大鼠心肌组织中总超氧化物歧化酶的活性变化。
　　8、Western blot检测Caspase-3蛋白的表达。
　　结果：
　　1、各组大鼠心律失常指标分析:与假手术组比较，I/R组大鼠室性心律失常发生率显著增加，VPB和VT发生率增加;与I/R组比较，给予紫檀芪预处理可显著降低室性心律失常发生率，降低VPB、VT的发生率;且随着剂量的增加，改变更加显著，大剂量组与小剂量组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
　　2、紫檀芪对VA评分的影响:说明紫檀芪预处理可显著降低心肌缺血再灌注损伤所致的室性心律失常发生率。
　　3、紫檀芪对大鼠心肌中ROS和SOD的影响:紫檀芪可能通过调节氧化应激反应，发挥心肌保护作用。
　　4、紫檀芪对大鼠心肌中GSH的影响:随着紫檀芪剂量的增加，促进GSH表达增高的作用更加显著。
　　5、紫檀芪对TNF-α和IL-1β的影响:随着紫檀芪剂量的增加，对TNF-α和IL-1β的抑制作用更加显著。
　　6、紫檀芪对大鼠心肌中Caspase-3的影响:加入紫檀芪预处理，可显著抑制Caspase-3表达，与I/R组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　7、紫檀芪对大鼠血清中SP的影响:与假手术组相比，I/R组大鼠SP分泌减少;紫檀芪预处理可显著促进SP分泌表达，且随着紫檀芪剂量增加，改变更加显著，大剂量组与小剂量组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论：
　　1、紫檀芪预处理可改善心肌缺血再灌注损伤所致的室性心律失常。
　　2、紫檀芪预处理可抑制心肌缺血再灌注损伤中炎性因子的表达，减少心肌细胞凋亡，发挥心肌保护作用。
　　3、紫檀芪预处理可改善缺血再灌注过程中氧化/抗氧化平衡，增加神经多肽SP的表达，减轻心肌缺血再灌注损伤。
　　第三部分 紫檀芪对心肌缺血再灌注中Rho-kinase的影响
　　目的：
　　探讨紫檀芪对心肌缺血再灌注中Rho-kinase的影响及其可能的作用机制。
　　方法：
　　1、健康雌性Wistar大鼠随机分为3组:(1)对照组:假手术组(sham组，12只);(2)心肌缺血再灌注模型组（I/R组，12只）;(3)紫檀芪作用组(12只):造模前给予紫檀芪预处理，40mg/kg紫檀芪溶液灌胃，每天1次，共计2周。
　　2、制备大鼠心肌缺血再灌注模型。
　　3、检测心肌梗死面积:心肌梗死面积的大小表示为AAR的百分比。即心肌梗死范围=NBT未染色区/伊文思蓝未染色区×100％
　　4、Real time PCR检测心肌组织中ROCK1和ROCK2的表达。
　　5、Western blot检测p-Akt和Rho-kinase的活性变化。Rho-kinase的活性通过检测其特异性底物肌球蛋白磷酸酶靶亚基(MYPT-1)的磷酸化水平来表示。
　　结果：
　　1、Rho-kinase的活性检测:I/R组中p-MYPT-1表达增加，与假手术组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）;但在加入紫檀芪预处理组中p-MYPT-1表达降低，与I/R组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。该结果提示紫檀芪可抑制缺血再灌注过程中Rho-kinase活性。
　　2、紫檀芪可降低心肌梗死面积:在I/R组中，AAR和心肌梗死面积分别是（54.17±3.73％）和（61.22±4.51％）。紫檀芪预处理组可显著降低AAR和心肌梗死面积，分别是（22.17±3.50％）和(41.11±4.65％)，与I/R组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　3、紫檀芪对ROCK1表达的影响:与假手术组相比，I/R组中ROCK1表达显著增加;而紫檀芪预处理组ROCK1表达降低，与I/R组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　4、紫檀芪对ROCK2表达的影响:与假手术组相比，I/R组中ROCK2表达显著增加（P＜0.05）;而紫檀芪预处理组未明显降低ROCK2的表达，与I/R组比较，差异不具有统计学意义。
　　5、紫檀芪对p-Akt的影响;与假手术组相比，I/R组中p-Akt的表达受到抑制;而紫檀芪预处理组p-Akt的表达显著增加，与I/R组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。提示缺血再灌注过程中紫檀芪可增加Akt活性。
　　结论：
　　1.心肌缺血再灌注损伤中，紫檀芪预处理可抑制Rho-kinase活性，降低ROCK1表达，减少心肌梗死面积，减轻缺血再灌注损伤。
　　2紫檀芪预处理可增加I/R过程中p-Akt的表达，提示紫檀芪可能是通过PI3-kinase/Akt通路发挥心肌保护作用的。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 心肌缺血再灌注和缺血预适应中Rho-kinase对PI3-kinase／Akt的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

附表

参考文献

第二部分 紫檀芪预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的作用研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

附表

参考文献

第三部分 紫檀芪对心肌缺血再灌注中Rho-kinase的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

附表

参考文献

文献综述 Rho-kinase在心肌缺血再灌注中的研究进展

致谢

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