LncRNA UCA1通过下调miR-27b表达增强胃癌多药耐药性的研究

摘要

第一部分 LncRNA UCA1在胃癌的发生发展中的作用
　　研究目的:LncRNA UCA1在胃癌的发生发展中的作用
　　研究方法:诊断为原发性胃癌且未进行化疗或放疗的56位患者行胃切除术，取胃癌组织和癌旁正常组织切除后立即用液氮进行冰冻，然后保存于-80℃以备用。首先把由4％多聚甲醛浸泡了48小时以后的由手术切除的胃粘膜组织，用石蜡进行包埋，再经4μm连续切片以后的用石蜡包埋好的组织再行HE染色，染色以后再由病理学专业的专家对上述切片给予分析和评价。再经免疫组化染色后提取胃癌样本总RNA，抽提细胞总RNA并进行变性琼脂糖电泳检测以及RNA逆转录反应。在进行反转录反应之后，应用Real-time PCR技术对lnc RNA、mRNA的表达丰度分别进行检测。
　　结果:
　　1.HE及免疫组化染色
　　胃癌组织和癌旁正常组织的石蜡标本经HE染色，病理学复查显示诊断和实验前诊断一致;免疫组织化学染色表明，胃癌组织标本呈现出高度表达，而癌旁正常组织基本上不作出表达。
　　2.胃癌组织中的lnc RNA表达水平明显上调
　　采用Real-time PCR方法对病理采集（癌组织和癌旁胃组织）中lnc RNAUCA1的表达进行检测，采集标本共56对。
　　lnc RNA UCA1在癌旁组织中的相对含量(1.29±0.26)低于癌组织(2.85±0.74)，Wilcoxon matched pairs test有显著统计学意义(p＜0.01)。表明lnc RNA UCA1极有可能是一种存在于胃癌组织中的促癌基因。
　　3.lnc RNA UCA1在胃癌和癌旁胃正常组织中相对含量的比值同胃癌的临床病理特征、临床预后相关进一步研究。
　　分析在56例胃癌以及胃癌旁组织内的lnc RNA表达出的相对含量的C/P比值与性别、年龄、癌肿大小、分期、浸润程度、分化情况、淋巴结侵袭之间的关系。
　　结果发现:C/P比值与肿瘤大小、肿瘤的分化程度有明显关联;其于低分化的胃癌病人中的表达有增加趋势，分析差异具有统计学意义;与性别、年龄无明显相关，分析差异没有统计学意义，但其和癌肿的浸润程度、淋巴结转移、TNM分期及远处转移亦无明显相关，分析差异没有统计学意义，怀疑此结果可能与样本量偏少有关。
　　在此过程中我们把56例标本平均分成两组，分别为C/P＞C/P平均值组和C/P＜C/P平均值组，对术后生存时间(hour)进行统计学分析。发现C/P＜C/P平均值组患者术后生存时间长于C/P＞C/P平均值组，且差异没有统计学意义，究其原因可能受随访时间过短及胃癌术后5年生存率较高等因素影响。
　　结论:lnc RNA UCA1与胃癌的发生、发展及分化程度相关，在胃癌中起到促癌基因的作用。
　　第二部分 LncRNA UCA1通过下调miR-27b表达增强胃癌多药耐药性
　　研究目的:探索UCA1和miR-27b在胃癌的发生发展中的联系，并进一步研究其在胃癌的多药耐药性中的作用。探讨lncRNA UCA1通过下调miR-27b的表达强度和胃癌的多药耐药性的关系。筛选和验证胃癌耐药相关lnc RNA分子。通过实验验证lnc RNA UCA1在胃癌的多药耐药性发生中所起的作用;并验证lncRNA UCA1能够调节胃癌多药耐药性的分子机理。
　　方法:异常表达的lncRNA的基因芯片数据来源于GEO数据库。采用实时荧光定量PCR的方法对28组癌症和癌旁的正常组织样本给予分析以评估lncRNAUCA1和miR27b的表达情况。采用人类胃癌细胞系SGC-7901细胞和SGC-7901衍生的具有阿霉素抗性的SGC-7901/ADR细胞，顺铂耐药的SGC-7901/DDP细胞和5-氟尿嘧啶耐药的SGC-7901/FU细胞作为体外细胞模型来评估UCA1和miR-27b在胃癌多药耐药性中的作用。诊断为原发性胃癌且未进行化疗或放疗的28位患者行胃切除术，取胃癌组织和癌旁正常组织切除后立即用液氮进行冰冻，然后保存于-80℃以备用。细胞培养和转染癌症细胞培养在RPMI-1640培养基内，并加入10％ FBS，100μg/mL青霉素，及100 U/mL链霉素。通过采用Ribobio试剂盒采用75 nM UCA1 siRNA或混合阴性对照(Ribobio)对SGC-7901/ADR，SGC-7901/DDP和SGC-7901/FU细胞进行转染，而采用100nMmiR-27b模拟物或阴性对照(Ribobio)对SGC-7901/ADR细胞进行转染，使用的试剂盒为Lipofectamine200048小时后，收集siRNA转染的细胞，并用qRT-PCR测定其抑制的程度。对与UCA1基因互补的DNA进行扩增，并插入到pcDNA3.1的BamhI/XhoI位点之间。采用pcDNA3.1-UCA1表达载体或50 nMmiR-27b抑制剂(Ribobio) SGC-7901细胞进行转染。胃癌组织和相应的癌旁正常组织的lncRNA表达谱的基因芯片数据调采用DIANA工具对UCA1和miR-27b的结合位点进行预测。采用TRIzol试剂提取组织及细胞样品的总RNA。进行反转录以获得一链cDNA。采用TaqMan MicroRNA Assay Kit进行实时荧光定量PCR分析。结果采用2-△△CT法进行计算。采用线性回归分析对UCA1表达的水平和miR-27b表达的水平的相关性进行评估。采用Cy3标记的抗生物素抗体在37℃反应30min时检测信号。采用DAPI来复染细胞核，然后用FV1000荧光显微镜检测免疫荧光。采用UCA1 siRNA或miR-27b模拟物对SGC-7901/ADR细胞进行转染，而采用UCA1表达载体或miR-27b抑制剂对SGC-7901细胞进行转染。转染24小时后，在96孔板上接种细胞。24小时后，用不同浓度的ADR，DDP或5-FU对细胞进行处理48小时。采用传统MTT芯片来对细胞活性进行测量。采用酶标仪来记录490nm的吸光度情况。通过绘制剂量-反应曲线计算IC50值。采用AnnexinⅤ-FITC Apoptosis DetectionKit来检测细胞的凋亡情况，采用流式细胞仪计算凋亡率。将含有30μg总蛋白的样品被置于每一条带上，然后用10％ SDS-PAGE进行分离。之后，电泳使蛋白样品转移至硝酸纤维膜上。对硝酸纤维膜进行封闭、洗涤并用抗BCL-2一抗(ab32124，Abcam)和裂解的半胱天冬蛋白酶-3(＃9661，Cell Signaling，Danvers，MA，USA)以及β-肌动蛋白(ab8227，Abcam)孵育过夜。洗涤之后，用HRP共轭的二抗对硝酸纤维膜进行孵育。采用化学发光超敏显色试剂盒super ECL detection reagent对蛋白条带进行视觉化。采用GraphPad Prism6.0进行数据分析。采用非配对双侧t检验方法来进行组间差异评估。p＜0.05表示差异具有统计显著性。
　　结果:
　　1.胃癌中UCA1和miR-27b呈负相关
　　在本部分中，我们首先通过提取GEO数据库的基因芯片数据研究了胃癌组织中异常表达的lncRNA。有一项近期的研究基于6个癌症组织样品和6个配对的癌旁组织样品对lncRNA的表达谱进行了分析。通过回顾他们的基因芯片数据(accession No.GSE53137)，我们观察到UCA1是胃癌组织样品中被最大程度上调表达的lncRNA之一。为了进一步验证这种异常表达情况，我们进一步基于28对癌症组织和癌旁正常组织样品进行了实时荧光定量PCR分析(qRT-PCR)。结果表明，UCA1在癌症组织中被显著上调(图2-1B)。与此同时，我们的qRT-PCR结果表明miR-27b，一种对胃癌细胞具有抑制多药耐药性的miRNA，在癌症组织中显著下降。通过线性回归分析，我们进一步确认了UCA1和miR-27b的负相关关系(R2=0.23，p=0.01)。然后，我们决定进一步调查它们之间是否存在什么关联，以及它们在胃癌细胞多药耐药性形成中的影响。
　　2.抑制UCA1可恢复MDR胃癌细胞中miR-27b的表达水平
　　通过qRT-PCR，我们发现MDR胃癌细胞，包括SGC-7901/ADR，SGC-7901/DDP和SGC-7901/5-FU细胞有进一步增加UCA1表达和降低miR-27b表达。很明显，生物信息分析表明UCA1有两个与miR-27b结合的可能位点。因此，我们决定调查看看UCA1是否对miR-27b的表达具有调控作用。FISH分析结果表明，UCA1和miR-27b在SGC7901和SGC-7901/ADR细胞的细胞核和细胞质中都有分布。UCA1在SGC-7901/ADR细胞中的表达量明显要更高，而miR-27b表达量则在SGC7901细胞中更高(图22-D)。接着，用UCA siRNA对SGC-7901/ADR，SGC-7901/DDP和SGC-7901/5-FU细胞进行转染。具有较高抑制作用的Si-UCA1-1被用于后续研究。QRT-PCR结果表明，对UCA1的抑制能够显著恢复miR-27b在MDR胃癌细胞内的表达。
　　3.UCA1抑制和miR-27b过量表达使MDR胃癌细胞对化疗试剂变得更加敏感
　　为了进一步调查UCA1和miR-27b在胃癌细胞MDR形成中的作用，我们采用MTT芯片对UCA1 siRNA或miR-27b模拟物转染后的SGC-7901/ADR细胞中的ADR，DDP和5-FU的IC50进行检测。结果表明，UCA1抑制和miR-27b过量表达都会降低SGC-7901/ADR细胞中的ADR， DDP和5-FU的IC50。接着，我们采用流式细胞仪检验用20μg/ml ADR处理后的SGC-7901/ADR细胞中ADR诱导的细胞凋亡。结果表明，UCA1抑制和miR-27b的增强表达的细胞能够显著增加ADR处理后的细胞凋亡。
　　因为想要进一步验证这些细胞中由ADR诱导的细胞凋亡，本课题组运用免疫印迹分析以检测抗凋亡蛋白BCL-2和凋亡蛋白裂解的半胱天冬蛋白酶-3的变化情况。结果表明，UCA1抑制和miR-27b过量表达在20μg/ml ADR处理后的SGC-7901/ADR细胞内显著降低了BCL-2表达并增加了半胱天冬蛋白酶-3的表达。上述结果显示UCA1抑制和miR-27b过量表达使MDR胃癌细胞对化疗试剂变得更敏感。
　　4.UCA1过量表达和miR-27b抑制使胃癌细胞产生了MDR
　　为了进一步调查UCA1和miR-27b对胃癌细胞的多药耐药性的调控作用，首先采用UCA1表达载体或miR-27b抑制剂对SGC-7901细胞进行转染。MTT芯片结果证实UCA1过量表达和miR-27b抑制增加了SGC-7901细胞的ADR，DDP和5-FU的IC50。后续的流式细胞仪分析表明UCA1过量表达和miR-27b抑制显著降低了ADR(10μg/ml)诱导的细胞凋亡。
　　LncRNA UCA1是胃癌细胞中的促癌因子;LncRNA UCA1能够下调miR-27b表达从而增强胃癌多药耐药性，本论文通过竞争内源性RNA理论为基础，从而把胃癌细胞多药耐药性相关的lnc RNA表达谱和mi RNA表达谱的数据进行统一合并分析，在ncRNA相互作用的层面表明了UCA1-mi RNA通路在胃癌MDR中的调节作用，
　　结论:在胃癌中，UCA1与miR-27b表达呈负相关关系。抑制UCA1可恢复miR-27b在癌症细胞中的表达。UCA1-miR-27b通路参与了癌症细胞的化学敏感性调节。

目录

声明

摘要

英文缩略词

前言

第一部分 LncRNA UCA1在胃癌的发生发展中的作用

引言

实验方法

结果

讨论

结论

附表附图

第二部分 LncRNA UCA1通过下调miR-27b表达增强胃癌多药耐药性

引言

实验方法

结果

讨论

结论

附表附图

文献综述

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文目录

致谢

发表论文