大肠癌患者血清肿瘤标志物的筛选及其功能研究

摘要

大肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤，也是全球癌症相关死亡的第二位主要原因。大肠癌患者的预后与肿瘤的临床分期关系密切，由于大肠癌患者早期常常无明显症状，大多数大肠癌患者确诊时已是晚期，错过了最佳治疗时机，确诊后即使行积极的根治性切除术，约60％的患者仍会发生局部复发或远处转移，严重影响患者的预后。在过去的几年中，由于大肠癌筛查的较广泛应用和治疗模式的改善，大肠癌患者的生存率不断提高。另一方面，大肠癌的发病率与生活方式和膳食结构密切相关。随着人们生活水平的提高，生活方式、饮食结构的改变以及人们预期寿命的增加，大肠癌的发病率也进一步提高，且有逐渐年轻化的趋势。及早发现大肠癌及其癌前病变，并行积极的干预治疗，是降低大肠癌发病率、提高患者生存率、延长患者生存时间的关键。因此，大肠癌的早期筛查具有十分重要的意义。
　　目前，大肠癌筛查的主要手段包括高灵敏度的粪便潜血试验和结肠镜检查。粪便潜血试验检测性能好、成本低、且病人无痛苦、无损伤性，是目前应用最广泛的大肠癌筛查方法。但粪便潜血试验特异性差、敏感性低。在许多其他疾病，如消化性溃疡、上消化道出血等疾病中，粪便潜血试验的结果也可能阳性，从而使一些非肿瘤患者最初诊治时误以为是肿瘤，给患者带来较大心理压力及后续繁琐的检查，消耗患者大量精力及财力。另一方面，只有当出血量达到一定量时，才能在粪便中检测到潜血，因此通过粪便潜血试验阳性检测出的多为晚期大肠癌患者。
　　结肠镜检查是目前大肠癌筛查最有效的手段，是大肠癌诊断的金标准。在美国，由于结肠镜筛查的逐步应用，50岁及以上成人大肠癌的发病率显著下降。但结肠镜检查程序复杂，价格昂贵，且普通结肠镜检查病人非常痛苦，有心脏病及凝血功能障碍等疾病的患者不能进行结肠癌检查，约三分之一的患者由于耐受性差放弃结肠镜检查。因此，结肠镜检查限制较多，不适合在无症状人群中直接开展结肠镜筛查。
　　血清肿瘤标志物是可用于癌症患者检测的一种简易方法，在临床上已有较普遍应用。癌胚抗原(CEA)和糖类抗原199(CA199)是目前最常用的大肠癌血清学肿瘤标志物。然而CEA和CA199在许多其他恶性肿瘤患者血清水平也有升高，对大肠癌诊断的特异性不高，且在早期大肠癌诊断中意义有限。开发、选择新的高灵敏度和高特异性的大肠癌血清肿瘤标志物具有重大的意义。
　　蛋白质组学是鉴定新的肿瘤标志物或肿瘤发生、发展过程中关键蛋白的有效方法，在肿瘤标志物的发掘方面具有重大的意义。抗体芯片是蛋白芯片的一种，是目前蛋白质组学研究的有效工具。该研究中使用人细胞因子抗体芯片同时检测274种细胞因子在大肠癌患者与正常对照组人群血清中的表达，为大肠癌早期筛查筛选出新的异常表达蛋白质，并进一步扩大样本量进行ELISA验证，从而为大肠癌的早期筛查提供新的肿瘤标志物CEACAM1、Cripto-1、VCAM-1和41BB;通过免疫组织化学的方法进一步研究这些肿瘤标志物在大肠癌组织中的表达及其与临床病理参数之间的关系，探索其在大肠癌发生、发展、预后判断、靶向治疗及疗效评估中的意义。
　　研究目的:
　　1、检测大肠癌患者与正常对照人群血清中蛋白质的表达，筛选出大肠癌患者血清中高表达的蛋白质，为大肠癌的早期筛查提供新的血清学肿瘤标志物。
　　2、检测大肠癌肿瘤组织及其对应的正常大肠粘膜组织中差异蛋白质的表达情况，分析其与临床病理参数的关系，探讨其在肿瘤发生、发展、治疗及预后判断中的意义。
　　材料和方法:
　　1、选取5例大肠癌患者术前血清及正常对照人群血清，应用RayBio公司的人细胞因子抗体芯片G-4000(AAH-CYT-G4000)筛选出大肠癌患者与正常对照人群血清中差异表达的蛋白质。
　　2、选取抗体芯片大肠癌患者血清中差异高表达的蛋白质，扩大样本量，在30例大肠癌患者血清中进行ELISA验证及统计学分析，分析其在大肠癌早期诊断中的价值，筛选出大肠癌早期诊断新的血清学肿瘤标志物。
　　3、应用免疫组织化学染色的方法检测大肠癌及其对应正常大肠粘膜石蜡组织中差异蛋白质的表达，分析其与临床病理参数的关系，探讨其在大肠癌发生、发展、治疗以及预后判断中的意义，为大肠癌靶向治疗及预后判断提供新的生物学靶点。
　　结果:
　　1、AAH-CYT-G4000抗体芯片检测274种蛋白质在大肠癌患者及正常对照人群血清中的表达，以P＜0.05定义为差异具有统计学意义。并计算各细胞因子的倍数改变以显示它们的相对表达水平，任何倍数改变≥1.5或≤1/1.5的信号强度认为有重大意义。蛋白芯片结果显示大肠癌患者及正常对照人群血清中有94种蛋白质差异表达，其中有66种蛋白质在大肠癌患者血清明显高表达，包括AFP、IL-17R、Cripto-1、CA199、CALCA、DKK-4、TG、CEACAM1、CEA、41BB、HER2/ErbB2、CDH1、IL-17F、Ubiquitin、NGF R、ANGPTL4、Angiostatin、CCL14、TGF beta2、CA9、BMP-5、CTSS、GDF-15、FSH、CD23、S-100b、TRAIL R2、VCAM-1, CA125, DKK-1, IP-10, beta2 M, MDC, DR6(TNFRSF21), Fas Ligand,LIF、Shh N、IL-2 Rbeta、TIMP-4、CRP、Adiposin, sgp130、hCG intact、HVEM、CA15-3、BMP-7、IL-13 R alpha1、LYVE-1、MMP-9、TNF-beta、IL-9、NAP-2、MIP-1 delta、ErbB3、PSA-free、IL-6、IL-18 Bpalpha、CD40 Ligand、NID1、IL-3、IL-1alpha、CXCL-16、Angiogenin、ALCAM、FSTN、BCAM。28种蛋白质在大肠癌患者血清明显低表达，包括IGFBP-2、VEGF R3、Insulin、Resistin、PDGFRbeta、VEGF R2、TREM-1、SCF R、TIMP-2、CD30、PDGF-BB、ICAM-2、Osteoprotegerin、PSA-total、TSH-β、Upar、Stnf RⅡ、EGF-R、MMP-3、L-Selectin、Sil-6 R、MICB、E-Selectin, Axl, HCC-4, TRAIL R3, Stnf-RI, MSP-alpha。
　　2、ELISA验证大肠癌患者血清差异表达蛋白质，结果显示大肠癌患者血清中CEACAM1、Cripto-1、VCAM-1和41BB蛋白水平明显高于正常对照人群，这4种蛋白质在大肠癌诊断中的价值均大于0.7，具有较高的敏感性及特异性，可以作为大肠癌筛查新的血清学肿瘤标志物。
　　3、免疫组织化学验证CEACAM1、Cripto-1、VCAM-1和41BB在大肠癌组织中的表达。结果显示CEACAM1、Cripto-1、VCAM-1和41BB在大肠癌肿瘤细胞中均呈阳性高表达。CEACAM1、Cripto-1、VCAM-1和41BB的高表达与临床分期相关，CEACAM1、Cripto-1和VCAM-1的高表达与淋巴结转移相关。
　　结论:
　　1、抗体芯片可以同时、高效地检测多种蛋白质在肿瘤患者血清中的表达，是一种较好的肿瘤标志物筛选手段。
　　2、CEACAM1、Cripto-1、VCAM-1和41BB在大肠癌患者血清中高表达，检测血清中CEACAM1、Cripto-1、VCAM-1和41BB水平有助于早期、无创地发现大肠癌患者，可以作为大肠癌早期筛查新的血清学肿瘤标志物。
　　3、CEACAM1、Cripto-1、VCAM-1和41BB在大肠癌肿瘤组织中高表达，且与肿瘤的临床分期及淋巴结转移相关，检测大肠癌肿瘤组织中CEACAM1、Cripto-1、VCAM-1和41BB的表达有助于判断大肠癌患者的预后，并可能成为大肠癌患者靶向治疗的新靶点。
　　本研究的创新之处:
　　1、应用AAH-CYT-G4000抗体芯片同时检测大肠癌患者与正常对照人群血清中274种细胞因子的表达，为大肠癌早期筛查提供新的血清学肿瘤标志物，通过扩大样本量进行ELISA验证及统计学分析，筛选出大肠癌新的血清学肿瘤标志物CEACAM1、Cripto-1、VCAM-1和41BB，为大肠癌早期诊断提供新的筛查工具。
　　2、免疫组织化学染色检测差异蛋白在大肠癌肿瘤组织中的表达，分析其与临床病理参数之间的关系，探索其在大肠癌发生、发展、治疗及预后判断中的意义，为大肠癌的靶向治疗和预后判断提供新靶点。

目录

声明

摘要

主要缩略词表

前言

第一章 大肠癌患者血清差异表达蛋白的筛选及其验证

材料和方法

结果

讨论

第二章 大肠癌血清差异蛋白的组织学表达

材料和方法

结果

讨论

参考文献

综述

致谢

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