髓系抑制细胞异常及网织血小板增多在ITP中的机制和诊断研究

摘要

本文从以下几方面进行论述：
　　第一部分:髓系抑制细胞功能异常在ITP中的作用及机制研究
　　免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia，ITP)是临床上最为常见的获得性出血性疾病，自身免疫紊乱是其发病的始动因素。血小板破坏增多和/或血小板生成减少是ITP的突出特点。
　　髓系抑制细胞(MDSCs)是一群髓系来源，且分化未成熟的异质性细胞，其特点是能够显著抑制T细胞应答，并在肿瘤、炎症和感染等状态下扩增。这些细胞参与血液循环，并在淋巴组织、骨髓、尤其是肿瘤微环境中聚集。小鼠的MDSCs表达特征性表面抗原Ly-6C/G和CD11b，而人类MDSCs特异性表达CD11b和CD33，同时低表达HLA-DR。MDSCs可通过γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)依赖的诱导型一氧化氮合酶(induced nitric oxide synthase，iNOS)途径或白细胞介素(interleukin，IL) IL-4/IL-13依赖的精氨酸酶1(Arginase-1，Arg-1)途径诱导T细胞无反应性。左旋精氨酸耗竭将导致T细胞信号分子CD3ζ表达降低和T细胞周期停滞。因此竞争左旋精氨酸代谢的两种酶Arg-1和iNOS在MDSCs抑制T细胞功能的机制中发挥关键作用。MDSCs的基因表达谱与正常单核细胞以及多形核中性粒细胞有所不同，其中Ets1被认为是与自身免疫相关的潜在因子。研究表明在自身免疫病小鼠模型中，MDSCs可以在体内抑制T细胞增殖并维持免疫稳态。但在人类自身免疫病中，MDSCs的作用尚未明确。
　　大剂量地塞米松(high-dose dexamethasone，HD-DXM)已被广泛应用于治疗ITP的一线方案中。文献证实4日HD-DXM方案有效扩增了ITP患者的调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)和髓系树突状细胞(myeloid dendritic cells，mDCs)，表明糖皮质激素(glucocorticoids，GCs)的免疫抑制作用可以纠正ITP患者免疫调节细胞的不足。此外，研究发现GCs可以在患者体内诱导产生一种单核表型的抗炎细胞，且与之对应的小鼠单核细胞亚群同肿瘤微环境中的MDSCs具有相似特性。尽管如此，GCs对ITP患者MDSCs功能的影响，以及该效应是否与疾病缓解相关未曾被阐明。通过体外诱导培养MDSCs并构建主动型慢性ITP小鼠模型，本研究将对GCs治疗ITP的分子机制提供新的解释，并探索以MDSCs为靶标的免疫治疗策略。
　　目的:
　　1)探究ITP患者MDSCs的数量和功能特点，明确其在疾病发生发展中的作用，以及HD-DXM对患者MDSCs的影响。
　　2)分别从体内和体外验证DXM对MDSCs功能的调控作用，并深入探讨发挥该作用的分子机制。
　　方法:
　　1) ITP患者及对照:分别收集治疗前、后ITP患者和正常对照者外周血，以及脾切除ITP患者和外伤性脾破裂者的脾脏。
　　2)构建主动型慢性ITP小鼠模型:用野生型C57BL/6小鼠的血小板免疫同种 CD61基因敲除(knock out，KO)小鼠，再将后者的脾脏细胞输给联合免疫缺陷(severe combined immunodeficient，SCID)小鼠。
　　3)流式细胞术:检测正常对照和治疗前、后ITP患者外周血中MDSCs的比例，以及胞内功能分子Arg-1和iNOS的表达。
　　结果:
　　1) ITP患者外周血及脾脏中的MDSCs较正常人显著减少，且功能异常。
　　流式细胞术检测结果示诱导前、后ITP患者循环及脾脏中CD11b+CD33+HLA-DRlow细胞的比例较正常人明显降低;免疫荧光检测结果示ITP患者脾脏中MDSCs的数量较正常人显著降低（均数±标准差，5.8±2.3 vs.2.6士1.8，P＜0.01）。功能分子Arg-1在ITP患者外周血及脾脏MDSCs中的表达均明显低于正常人（平均荧光强度，中位数7.0[范围6.0-9.7] vs.中位数9.3[范围7.0-13.0]），而iNOS的表达均显著高于正常人（中位数13.0[范围3.5-23.5] vs.中位数2.1[范围1.5-3.0]，P＜0.01）。
　　2)HD-DXM可以扩增ITP患者的MDSCs，并提高其抑制性细胞因子的表达。
　　接受HD-DXM治疗的ITP患者循环中CD11b+CD33+HLA-DRlow细胞的比例较治疗前明显升高。DXM在体外扩增外周血及脾脏来源MDSCs的最佳作用浓度是0.5μM，该浓度体系中CD11b+CD33+双阳性细胞的比例显著高于DXM未处理组（均数±标准差，62.77±7.02 vs.84.02±9.53，P＜0.01）。同时，实时定量PCR示DXM的调节作用显著提高了ITP患者外周血及脾脏来源MDSCs中IL-10、TGF-β和VEGF的表达水平，使MDSCs的免疫抑制功能有效增强。
　　结论:
　　1) MDSCs数量减少及功能异常共同参与ITP的发病。HD-DXM可以扩增ITP患者MDSCs的比例并纠正其免疫抑制功能。
　　2) DXM在体外增强了ITP患者MDSCs对T细胞的抑制作用;同时在体内改善了主动型慢性ITP模型小鼠血小板减少的相关症状。
　　3)DXM通过转录因子Ets1发挥对ITP患者MDSCs功能的调节作用。该发现为GCs治疗ITP的分子机制提供了新的解释，并提出了以MDSCs为靶标的免疫治疗策略。
　　第二部分:网织血小板比例升高在ITP鉴别诊断中的预测价值
　　目前，ITP的诊断方法综合考虑血小板相关免疫球蛋白(platelet-associatedimmunoglobulin，PAIg)、网织血小板比例(the percentage of reticulatedplatelets，％RP)、血浆血小板生成素(thrombopoietin，TPO)水平的检测，和骨髓细胞形态学检查等。与应用全血细胞自动计数仪（如XE-2100 or XN-1000）检测IPF相比，应用FCM检测％RP来鉴别ITP所得到的敏感性和特异性更高。低浓度的TO可以特异性识别RP，但浓度偏高时还能结合血小板中的致密颗粒，因此小心控制染料的用量对试验的成败至关重要。诊断不明的ITP患者时有预防性用药或过度治疗的情况存在。为了进一步明确诊断，有创检查如骨髓穿刺术往往难以避免。本研究将通过前瞻性多中心双盲试验，探索％RP在原发性ITP鉴别诊断中的意义和价值，为该病的确诊提供一种临床可推广的实验室检查手段。
　　目的:
　　研究FCM法检测％RP在成人原发ITP鉴别诊断中的预测价值，并提出临床可供参考的临界值。
　　方法:
　　1)试验设计:本研究在山东省六家医疗中心开展，研究计划得到各单位伦理委员会审核批准，参与者纳入前均签署知情同意且符合赫尔辛基宣言的有关要求。我们采用前瞻性的方法将试验分为推导队列和验证队列两部分。推导队列（524人）将得出％RP的截断值;验证队列（1018人）将评估该截断值诊断ITP的预测值。研究者采用盲法把资料收集和实验操作分开进行。同时，牵头研究中心的专家组对纳入的参与者进行诊断的判别和确立。
　　2)入排标准:18岁以上成年男/女患者，血小板计数小于60×109/L，伴或不伴有出血症状者符合纳入标准;纳入前三个月内接受过ITP相关治疗（如应用TPO受体激动剂等），继发性ITP，血清病毒学阳性，或严重的肝肾功能损伤者被排除。
　　结果:
　　1)基线特征
　　2016年11月6日至2017年12月5日，对1542份样本进行分析:年龄、性别、基线血小板计数以及中位出血评分在推导队列和验证队列之间无统计学差异。约70％纳入者伴随出血症状，其中位出血评分为4（范围0-13）。
　　2) ITP患者％RP较其他血小板减少症患者显著升高专家组对纳入者分组诊断如下:18.7％为原发性ITP;9.7％为再生障碍性贫血（aplastic anemia，AA）;48.9％为化疗引起的血小板减少症(chemotherapy-induced thrombocytopenia，CIT);22.7％为骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes，MDS)、脾肿大、阵发性睡眠性血红蛋白尿(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)等。应用流式细胞术检测％RP示，ITP患者％RP较其他血小板减少症患者显著升高（P＜0.0001）。同时，应用ELISA检测血浆TPO水平示，ITP患者血浆TPO浓度与正常对照者无明显差异，而AA和CIT患者血浆TPO浓度显著高于正常对照者(P＜0.0001)。细胞形态学检查示，网织血小板可见于部分ITP患者外周血涂片中，表现为带有煌焦油蓝着色颗粒且体积偏大的血小板。
　　结论:
　　1)我们采用前瞻性多中心双盲试验，证实应用流式细胞术检测％RP为ITP的确诊提供了一种简单、无创且准确的实验室检查手段。
　　2)％RP的截断值8.6％在ITP的鉴别诊断中具有较高的预测价值。该预测模型有望广泛应用于成人原发ITP的临床筛查。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分：髓系抑制细胞功能异常在ITP中的作用及机制研究

前言

材料方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

第二部分：网织血小板比例升高在ITP鉴别诊断中的预测价值

前言

材料方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

英文正文

致谢

攻读博士学位期间发表学术论文及参加学术会议