丹参酮抑制脑梗死大鼠模型中的神经元细胞凋亡和炎症反应的实验研究

摘要

目的:
　　本次研究采用脑梗死大鼠模型和缺氧缺糖(OGD)神经元细胞模型来分别评价丹参酮预处理对于脑梗死大鼠脑梗死体积、脑水肿程度、神经功能缺损、细胞调亡以及炎症反应的影响情况，从而了解丹参酮对于脑梗死的体外体内的治疗作用和其可能的影响机制。
　　方法:
　　(1)选取45只健康雄性Sprague-Dawley大鼠(250-280g)随机等量分配到3个分组内（每个分组n=15）:假手术(Sham)组（简称对照组）、大脑中动脉栓塞再灌注(MCAO)组（简称MCAO组）和丹参酮预处理组（简称TSN组）。TSN分组中的大鼠需连续7天每天接受丹参酮注射液(5mg/kg)的腹腔内注射。之后对MCAO和TSN分组中的大鼠实施MCAO手术。对照组中的大鼠也接受MCAO的所有手术操作，但不进行插线结扎处理。
　　(2)经过24小时的再灌注后，将三组小鼠按五级4分评分法开展神经功能缺损评价。
　　(3)经过24小时的再灌注后处死大鼠，从MCAO和TSN分组大鼠的脑梗死部位及对照组大鼠的对应部位内采集脑组织样本，对三组大脑的含水量分别进行测量以评价各组脑水肿情况。
　　(4)分别经过6小时、24小时、3天、7天、14天的再灌注后，将三组大鼠快速切除大脑。沿冠面将前脑切片，将切片染色后观察各时间段脑梗死体积的大小，从中选取再灌注24小时的染色脑切片拍照，然后使用Image J分析软件来测量三组各切片的脑梗死体积。
　　(5)收集三组大鼠体内海马体和大脑皮层组织，经脱蜡脱水处理后采用TUNEL方法利用原位细胞死亡检测试剂盒来检测组织系统中的DNA片段。在光学显微镜下观察并记录三组样本各自的细胞凋亡情况。
　　(6)将三组大鼠皮层组织使用对应的酶联免疫吸附剂测定(ELISA)试剂盒分别测定TNF-α、CRP和IL-6的含量水平。
　　(7)使用5只出生约1天的新生大鼠来分离出原代神经元细胞。神经元细胞被划分成对照组、缺氧缺糖(OGD)组和丹参酮预处理(TSN)组。TSN组中的细胞在DMEM培养基内培养5天并伴随使用5μg/mL的丹参酮原液。随后在OGD组和TSN组中实施OGD处理，经过4小时的培养后再将基质更换为正常培养液行复氧处理。而对照组的细胞在5％CO2的条件下进行培养。
　　(8)经处理的细胞分别接受24、48、72小时的培育。每天同时将MTT(10μl，5mg/mL)试剂添加到各培养皿内，然后对细胞进行4小时的培育。然后应用多功能全自动定量绘图酶标仪检测各组细胞的活性，同时使用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒来检测各组细胞凋亡的情况。
　　(9)分别对3个分组内的细胞进行收集，经实时荧光聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术与蛋白质免疫印迹(Western Blot)法分别检测Bcl-2和Bax中的mRNA与蛋白质表达水平的变化并验证两者是否一致。
　　(10)以上数据使用SPSS19.0统计分析软件进行分析。连续变量采用平均值±S.D来表示并应用单因素方差(one-way ANOVA)加以分析，组间比较采用t检验，P值＜0.05即可认定为具有统计学显著性差异。
　　结果:
　　(1)和无任何治疗处理的脑梗死大鼠对照组相比，MCAO分组的大脑含水量、脑梗死的体积与神经功能缺损评分情况均显著提高（全部P＜0.01）。与MCAO分组相比，使用TSN预处理则可大幅降低大脑含水量(P＜0.05)、脑梗死体积(P＜0.01)和神经功能缺损评分(P＜0.05)。
　　(2)与对照组相比MCAO手术会显著提高大鼠海马体和皮层组织内的神经元细胞凋亡（全部P＜0.01），而TSN分组中海马体和皮层组织内的细胞凋亡则显著低于MCAO分组（海马体:P＜0.05;皮层组织P＜0.01）。
　　(3)MCAO分组中的TNF-α、CRP和IL-6水平都显著高于对照组(全部P＜0.01)，而TSN分组中的TNF-α、CRP和IL-6水平都低于MCAO分组(TNF-α、CRP:P＜0.01;IL-6:P＜0.05)。
　　(4)MTT结果发现，在处理后的24小时、48小时和72小时后，OGD分组中的细胞活性均明显低于对照组（P＜0.05或P＜0.01），而经TSN的预处理后相比于OGD分组则均能够明显增强细胞活性（P＜0.05或P＜0.01）。
　　(5)流式细胞仪检测结果表明，和对照组相比，OGD分组的细胞凋亡率显著提高(P＜0.01)，而相对于OGD分组，TSN分组中的则可显著抑制细胞凋亡(P＜0.01)。
　　(6)与对照组相比，OGD分组中观察到抗凋亡蛋白Bcl-2中的mRNA和蛋白质水平的显著抑制(P＜0.01)而促凋亡蛋白Bax中的mRNA和蛋白质水平则明显增加(P＜0.01)，而TSN和OGD分组相比则能够显著逆转Bcl-2和Bax中的mRNA和蛋白质表达水平上的这些变化(Bcl-2:P＜0.05;Bax:P＜0.01)。
　　结论:
　　本次研究证明，丹参酮预处理可显著改善脑梗死大鼠的脑梗死体积、脑水肿和神经功能缺损情况。脑梗死大鼠海马体和大脑皮层内的细胞凋亡以及IL-6、TNF-α和CRP水平在丹参酮预处理后都得到了有效的抑制。此外，丹参酮通过调节缺氧缺糖(OGD)神经元细胞中Bax的下调和Bcl-2的上调还能显著提高细胞活性并抑制细胞凋亡。综上所述:丹参酮通过抑制神经元细胞凋亡和体内体外炎症反应而起到预防治疗脑梗死的作用。
　　意义:
　　丹参酮及其结构类似物目前已经广泛应用于临床，在治疗感染性疾病、心脑血管疾病、肿瘤疾病、糖尿病、呼吸系统疾病、五官、口腔疾病、骨科疾病及妇科疾病等方面，均体现出较好疗效。丹参酮制剂具有使用方便、安全、经济等的优势，其口服由肠道吸收，药效可快速布散于人体，作用强、排泄缓慢、无耐药性及毒副作用，值得我们广泛应用。以往临床研究也证明丹参酮可以治疗脑梗死并有着独特的疗效，但其作用机理至今并没有得到充分的研究。本次研究则证明了丹参酮是通过增强神经元细胞的活性抑制神经元细胞凋亡和显著的抗炎作用从而达到预防治疗脑梗死的机理，这为临床用药提供了理论支持，并且可为未来脑梗死的治疗指明潜在的研究方向。
　　不足之处:
　　因各种客观原因，此次研究仍缺乏大样本、多中心的双盲对照等大数据支持，并且只限于动物实验和体外细胞实验;此外，此次只研究了丹参酮的抗炎和抗凋亡作用，没有进一步深入研究其不同活性成分如丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA及隐丹参酮等的各自具体的作用特点及其作用机制，这些都将是我未来着重研究的方向。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 丹参酮抑制脑梗死大鼠模型中的神经元细胞凋亡和炎症反应的实验研究

背景

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

附图表

参考文献

第二部分 丹参酮抑制缺氧缺糖原代大鼠神经细胞凋亡的实验研究

背景

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

附图表

参考文献

第三部分 综述 丹参酮治疗缺血性脑卒中的临床研究进展

致谢

攻读博士期间发表的论文

The first part Research progress of Tanshinone’s pharmacological action and clinical application

The second part Tanshinone inhibits neuronal cell apoptosis and inflammatory response in cerebral infarction rat model