蛋白质O-GlcNAc糖基化在顺铂抗肿瘤活性中的作用研究

摘要

O-连接的N-乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)是指将单个β-N-乙酰葡糖胺连接到细胞核和细胞质蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基上的一种翻译后修饰。细胞O-GlcNAc水平受两种关键酶的调节:O-GlcNAc transferase（O-GlcNAc糖基转移酶，OGT）和O-GlcNAcase（O-GlcNAc糖苷酶，OGA），分别参与GlcNAc的添加和去除。细胞外环境的变化可导致O-GlcNAc的水平迅速改变，当刺激去除后蛋白质的O-GlcNAc糖基化水平恢复到基线水平。O-GlcNAc稳态的过程对调节许多细胞功能（包括细胞周期进程、应激反应和基因转录等）至关重要。体内O-GlcNAc糖基化平衡的破坏与多种疾病的发生有关，如癌症、心血管疾病和阿尔茨海默病等。在我们的前期研究中使用顺铂(CDDP)、阿霉素(ADM)和长春新碱(VCR)等三种抗肿瘤药物分别作用于肺癌细胞H1299、肝癌细胞HepG2、乳腺癌细胞MCF-7，结果发现肿瘤细胞内的蛋白质O-GlcNAc糖基化水平均显著增高且具有一定的规律性。因此，本论文研究CDDP诱导蛋白质O-GlcNAc糖基化变化的规律及其机制，研究O-GlcNAc糖基化变化对CDDP抗肿瘤活性的影响。
　　由于O-GlcNAc糖基化的程度的改变主要受OGT/OGA和供体UDP-GlcNAc的调节，因此本论文研究了CDDP对OGT/OGA活性、蛋白表达水平和mRNA水平的变化;研究了CDDP对供体UDP-GlcNAc以及ATP等能量代谢的影响;研究了CDDP对O-GlcNAc糖基化的蛋白质表达谱的影响。同时，通过使用抑制剂，在体内外研究了蛋白质的O-GlcNAc的糖基化程度的变化对CDDP抗肿瘤作用的影响。
　　在体外实验中，通过western blotting法检测三种抗肿瘤药物CDDP、ADM和VCR对肿瘤细胞H1299、HepG2和MCF-7糖基化的影响，结果发现，经过药物作用后细胞内的O-GlcNAc糖基化的程度都显著上升且具有浓度上的依赖性。0、2、8和16μg/mL等不同浓度的CDDP作用于肺癌细胞H1299时，OGA、OGT、PFK1、PKM2、GFAT1等相关蛋白的表达水平没有显著差异。HK2、GRP78和CHOP的表达程度随着CDDP作用浓度的增高显著降低并具有浓度的依赖性。RT-qPCR结果显示，随着CDDP作用浓度的上升OGA、OGT的mRNA的水平显著增长且具有浓度上的依赖性。通过OGA、OGT活性实验检测发现，随着CDDP作用浓度的增加，OGA的活性显著降低且具有浓度依赖性，而OGT的活性没有发生显著的变化。结果表明，OGA活性降低是CDDP诱导O-GlcNAc升高的其中的一个原因。
　　磺酰罗丹明B（sulforhodamine B，SRB）比色法测定CDDP单独及与OGA的抑制剂TMG/PUGNAc联合作用对肺癌细胞H1299增殖的影响，实验结果表明CDDP对H1299有显著的抑制作用且具有浓度上的依赖性;与CDDP单独给药组相比，CDDP与10μM TMG或100μM PUGNAc联合给药对肺癌细胞H1299的增殖抑制作用无显著性差异。检测细胞的凋亡结果表明，浓度为0、8、16和64μg/mL的CDDP单独给药时，细胞凋亡率分别为7.48％、13.88％、26.97％和53.06％，当CDDP与10μM TMG联合给药时，细胞的凋亡率分别为9.55％、14.04％、24.65％和44.8％;CDDP与100μM PUGNAc联合给药时，细胞的凋亡率分别为16.12％、23.68％、30.07％和50.4％;结果表明，相较CDDP给药组，CDDP与TMG或PUGNAc联合给药组没有显著地影响细胞的凋亡。上述结果表明TMG或PUGNAc所诱导的O-GlcNAc的程度的升高不影响CDDP对细胞的增殖抑制，也没改变CDDP诱导的细胞凋亡。
　　SRB法检测CDDP独自及与OGT抑制剂Alloxan联合作用对细胞H1299增殖抑制的影响，实验发现，与CDDP单独给药组相比，CDDP与10mM Alloxan联合给药对细胞的增殖抑制没有显著变化;细胞凋亡的结果显示，0、8、16和64μg/mLCDDP单独给药H1299细胞时的凋亡率为7.48％、13.88％、26.97％和53.06％，CDDP与10mM Alloxan联合给药时细胞的凋亡率分别为19.53％、34.26％、55.02％和74.67％。联合给药的细胞凋亡率明显比CDDP给药组高，结果表明，OGT抑制剂Alloxan降低蛋白质O-GlcNAc的水平后并不影响CDDP对细胞的增殖抑制。
　　在研究CDDP诱导的蛋白质O-GlcNAc糖基化的程度与细胞内UDP-GlcNAc含量的关系时，我们发现在肺癌细胞H1299中，随着CDDP作用浓度的增加细胞内的UDP-GlcNAc含量从1.9mmol/1011cells上升至4.34mmol/1011cells且具有浓度依赖性;随着CDDP作用时间的增加，UDP-GlcNAc含量从0.65mmol/1011cells上升至4.34mmol/1011cells且具有时间依赖性。当用GFAT1的抑制剂DON作用于肺癌细胞时，随着DON浓度的升高，细胞内的UDP-GlcNAc含量从1.77mmol/1011cells下降至0.88mmol/1011cells且具有浓度依赖性;而在DON为40μM时，随着DON作用的时间的增加，其内的UDP-GlcNAc含量从0h的1.33mmol/1011cells下降至作用48h的0.61mmol/1011cells且具有时间依赖性。相比CDDP给药，CDDP与DON联合给药组的蛋白质O-GlcNAc的程度降低且具有浓度的依赖性。western blotting法测定CDDP与葡萄糖/谷氨酰胺联合给药对O-GlcNAc糖基化程度的影响，研究结果发现，相较于CDDP给药组，联合给药组中O-GlcNAc糖基化的程度显著增高。上述的实验表明，UDP-GlcNAc浓度与CDDP诱导的O-GlcNAc程度的升高有关。
　　通过相关试剂盒检测发现不同浓度的CDDP作用于肺癌细胞时，细胞内的ATP含量从0.33mmol/104cells上升至0.73mmol/104cells，细胞内葡萄糖的含量从2.43μmol/109cells上升至4.83μmol/109cells、细胞内丙酮酸的含量从1.6μg/107cells上升至3.8μg/107cells且均具有浓度依赖性。能量代谢与CDDP诱导的O-GlcNAc糖基化升高之间的机制有待进一步研究。
　　我们通过质谱分析进一步检测了CDDP诱导的O-GlcNAc糖基化蛋白质表达谱的变化及糖基化变化的程度，结果显示，使用O-GlcNAc抗体通过免疫沉淀技术富集糖基化的蛋白质，质谱分析结果表明，部分蛋白质只在对照组表达，部分蛋白质只在CDDP给药组表达，有些蛋白在两组均表达但表达水平有差异。
　　在裸鼠的体内实验中，我们选用了PBS组、4mg/kg CDDP组、8mg/kg CDDP组、1mg/kg PUGNAc组及4mg/kg CDDP和1mg/kg PUGNAc联合给药组进行试验，通过对裸鼠的瘤块体积进行测定，计算出这四组的抑瘤率分别为13％、83％、5％和14％。通过western blotting法检测肿瘤组织、肺组织和肝脏组织中蛋白质的O-GlcNAc糖基化的程度及OGA、OGT的表达程度发现，在4mg/kg和8mg/kgCDDP剂量下，三个组织中的蛋白质O-GlcNAc糖基化的程度及OGT的表达水平没有发生明显的变化，OGA在肿瘤组织中的表达量随着CDDP浓度的增加显著升高且具有剂量的依赖性;而PUGNAc单独给药组在肝脏组织和肿瘤组织中的O-GlcNAc糖基化的程度显著上升。结果表明，CDDP没有改变裸鼠肿瘤组织的O-GlcNAc糖基化的程度，OGA的抑制剂PUGNAc可以升高肿瘤组织的O-GlcNAc糖基化的程度，但PUGNAc单独对肿瘤的生长没有明显的抑制作用，PUGNAc与CDDP联合使用也没有改变CDDP对肿瘤生长的抑制作用。
　　综上所述，本研究得出如下结论:CDDP诱导的O-GlcNAc糖基化程度的升高主要由OGA的活性下降以及UDP-GlcNAc浓度升高引起的;升高或者降低O-GlcNAc糖基化的程度没有改变CDDP对细胞增殖抑制，也不能影响CDDP对荷瘤的裸鼠肿瘤生长的抑制。本研究在蛋白质糖基化方向为解决CDDP耐药、提高肿瘤细胞对CDDP的药物敏感性进行了探索，为研究糖基化与药效关系奠定了良好基础。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

1．2 O-GlcNAc糖基化修饰的供体UDP-GlcNAc

1．3 蛋白质的O-GlcNAc糖基化与应激反应

2 本课题的研究意义

3 本课题拟解决的问题

第二章 顺铂诱导的蛋白质O-GlcNAc糖基化变化与OGA／OGT的相互关系以及OGA／OGT对顺铂抗肿瘤活性的影响

1 实验材料

2 仪器设备

3 实验方法

3．1 Western blotting测定药物对细胞蛋白质表达的影响

3．2 实时定量PCR测定OGA、OGT的mRNA水平

3．3 H1299细胞中OGA活性的测定

3．4 H1299细胞中OGT活性的测定

3．5 牛晶状体蛋白在大肠杆菌中的表达

3．6 细胞质蛋白和细胞核蛋白的提取

3．7 SRB法检测肿瘤细胞的增殖

3．8 Annexin V-FITC／PI法测定肿瘤细胞的凋亡

4 实验结果

4．2 CDDP对蛋白质O-GlcNAc糖基化及相关蛋白表达的影响

4．3 H1299细胞中CDDP对OGA和OGT的mRNA水平的影响

4．4 H1299细胞中CDDP对OGA和OGT活性的影响

4．5 H1299细胞中CDDP对OGT和OGA的细胞内分布的影响

4．6 OGA抑制剂对CDDP诱导的O-GlcNAc糖基化的影响

4．7 OGA抑制剂对CDDP诱导的细胞增殖抑制的影响

4．8 OGA抑制剂对CDDP诱导的细胞凋亡的影响

4．9 OGT抑制剂对CDDP诱导的O-GlcNAc糖基化的影响

4．10 OGT抑制剂对CDDP诱导的细胞增殖抑制的影响

4．11 OGT抑制剂对CDDP诱导的细胞凋亡的影响

5 讨论

第三章 顺铂诱导的蛋白质O-GlcNAc糖基化变化与供体UDP-GlcNAc的相互关系以及UDP-GlcNAc的浓度对顺铂抗肿瘤活性的影响

1 实验材料

2 仪器设备

3 实验方法

3．1 HPLC检测肿瘤细胞中UDP-GlcNAc含量

3．2 肿瘤细胞中ATP含量的测定

3．3 肿瘤细胞中葡萄糖含量的测定

3．4 肿瘤细胞中丙酮酸含量的测定

4 实验结果

4．1 CDDP对肺癌细胞中UDP-GlcNAc含量的影响

4．2 GFAT1的抑制剂DON对H1299细胞中UDP-GlcNAc含量的影响

4．3 GFAT1的抑制剂DON对CDDP诱导的蛋白质O-GlcNAc糖基化变化的影响

4．4 葡萄糖对CDDP诱导的蛋白质O-GlcNAc糖基化变化的影响

4．5 谷氨酰胺对CDDP诱导的蛋白质O-GlcNAc糖基化变化的影响

4．6 CDDP对H1299细胞中ATP含量的影响

4．7 CDDP对H1299细胞中葡萄糖含量的影响

4．8 CDDP对H1299细胞中丙酮酸含量的影响

5 讨论

第四章 顺铂对O-GlcNAc糖基化蛋白质的表达谱差异分析

1 实验材料

2 仪器设备

3 实验方法

3．1 细胞中O-GlcNAc糖基化蛋白质的制备

3．2 银染法初步检测糖基化蛋白质的差异

3．3 O-GlcNAc糖基化蛋白质表达差异的质谱分析

4 实验结果

4．1 SDS-PAGE电泳考染结果

4．2 质谱鉴定

5 讨论

第五章 在动物体内顺铂活性与蛋白质O-GlcNAc糖基化的关系

1 实验材料

1．1 细胞株

1．2 实验动物

1．3 主要试剂

2 仪器设备

3 实验方法及步骤

3．1 移植瘤模型的构建

3．2 裸鼠肿瘤组织和正常组织中蛋白质糖基化水平的测定

4 实验结果

4．1 药物对裸鼠体重及肿瘤体积的影响

4．2 在裸鼠肿瘤组织中CDDP对蛋白质O-GlcNAc糖基化的影响

4．3 在裸鼠正常组织中CDDP对蛋白质O-GlcNAc糖基化的影响

5 讨论

全文总结

参考文献

致谢

硕士期间发表的论文