石油污染对土壤微生物群落结构影响及菲降解菌的筛选鉴定

摘要

天然石油是由各种碳氢化合物组成的复杂混合物，在开采、运输、加工等过程中释放到环境中的烃类化合物正是土壤污染的主要原因之一，石油污染物在环境中长期积累且难被消除，对生态系统及人类健康造成严重危害。石油污染物对土壤中的一些微生物具有毒害抑制作用，而有些微生物能降解转化石油烃并为自身提供碳源和能源，所以石油污染物会改变土壤微生物多样性和群落结构，土壤石油污染与微生物群落的多样性和群落结构的关系值得深入研究。
　　本研究中，第一部分内容旨在找出油污土中微生物菌群结构的特征，揭示石油污染对土壤微生物多样性的影响，采用二代高通量测序平台，对准东油田不同污染程度的油污土和背景土中的细菌（16S rRNA序列）和真菌（ITS序列）特征序列进行测定和比对，并对结果进行生物信息学分析。第二部分内容为了进一步分离纯化准东油污土中的菲降解菌，以芳香烃菲为唯一碳源，连续五次进行液体富集培养后，离心收集菌体，提取菲降解菌基因组DNA并进行PCR扩增，利用二代高通量测序平台对菲降解菌的16S rRNA进行测序和比对，并对结果进行生物信息学分析。研究结果如下：
　　1、利用 miseq平台对不同油污土样和背景土样的土壤微生物进行测序，并对序列进行修剪优化后，共得到97036个真菌ITS序列、93033个细菌16S rRNA序列；利用Usearch软件对优化序列进行OTU分类及同源比对，得到了5门、18纲、45目、76科、126属、180种共15349个真菌，其中优势菌群为子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）；得到16门、31纲、72目、134科、230属、310种共13346个细菌，其中的优势菌群为放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）及变形菌（Proteobacteria），其中厚壁菌门在石油污染样本中含量剧减，说明石油污染物对厚壁菌门有一定的抑制毒害作用，而放线菌门和变形菌门在石油污染样本中含量剧增，可能是因为这两种菌能降解石油烃。
　　2、通过对各样本的多样性指数分析可知，样本中的真菌Chao/ Ace丰度指数依次为2B>3A>1B>1A>2B>3B，Simpson/shannon指数显示样本3B的多样性最高，总体而言真菌菌群结构受石油污染的影响较小。样本中的细菌Chao/Ace丰度指数依次为2A>1A>3A>2B>1B>3B，Simpson/shannon指数显示多样性最高的是样本3A，其次是1A，整体上看，一定浓度的石油污染能提高土壤细菌丰度和多样性。
　　3、使用Qiime软件对样本微生物进行聚类分析，对于真菌菌群而言，1A为一类，剩下的五个样本为一类，距离最近的是样本是2A和2B，距离最远的是样本1A和样本2A/2B，距离均为0.18；对于细菌菌群而言，1A为一类，剩下的五个样本为一类，样本1B/3B及样本2A、3A之间的距离最近，距离最远的是样本1A和样本1B/3B，距离均为0.23。这说明石油污染物及污染程度都在一定程度上影响土壤微生物的遗传进度及结构，细菌菌群受到的影响更为明显。主成分分析结果表示各样本间差异度主要由石油污染物造成，污染年限为5年的样本1A与污染年限只有1年和3年的2A、3A之间存在较大差异。这说明长达五年的生物降解使得1A土样中的污染物成分发生较大改变，使样本1A的特异性更加明显。同时，不同污染年限的样本土壤之间也存在较大差异，这表明不同的污染物成分和不同污染物浓度都在很大程度上影响了环境中的群落结构和特征。
　　4、菲降解菌液体富集培养后，经过测序分析共得到33个OTU序列，共得到4门、8纲、14目、13科、26属共27种细菌菌株，总共43630个reads。其中变形菌门占95％，为最优势菌群。α-变形菌菌纲（Alphaproteobacteria）下的鞘脂单胞菌（Sphingomonadaceae）数量最多，比例在85%以上，其次是β-变形菌纲（Betaproteobacteria）下的草酸杆菌（Oxalobacteraceae），占整体的14%。这表明这两种菌能高效降解并利用菲完成自身的生长繁殖。
　　5、通过 PCA分析，对样本中菲降解菌群落特征的贡献最大的主成分应该是菲含量，贡献率为57.86%，其次应该为是无机盐成分，贡献率为42.14%。

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第一章 绪论

1.1 研究综述

1.1.1 石油污染土壤现状及危害

1.1.2 石油成分及微生物修复技术

1.1.3 石油污染的微生物修复的影响因素

1.1.4 石油污染对土壤微生物菌群结构影响

1.1.5 石油有机污染物降解菌的研究

1.2 本研究的内容、目的及意义

1.2.1 研究区概况

1.2.2 研究内容

1.2.3 研究目的和意义

1.3技术路线

第二章 石油污染土壤中微生物菌群结构研究

2.1材料和方法

2.1.1 土壤样品采集

2.1.2 实验试剂盒设备

2.1.3土壤微生物的基因组DNA的抽提

2.1.4 土壤微生物基因组DNA的PCR扩增及检测

2.1.5 基因组DNA的荧光定量和序列优化

2.1.6 OTU生成及归类统计

2.1.7 土壤微生物的菌群结构组成分析

2.1.8 土壤微生物的多样性指数分析

2.1.9 主成分分析

2.1.10 Heatmap图

2.2 结果及分析

2.2.1 有效序列统计及序列优化

2.2.2 OTU分布统计

2.2.3 构建稀释曲线

2.2.4 OTU分布Venn图

2.2.5 OTU片段的归类统计

2.2.6 菌群结构组成分析

2.2.7 真菌多样性指数分析

2.2.8 细菌多样性指数分析

2.2.9 主成分分析

2.2.10 Heatmap图

2.3 讨论

2.3.1 样品中真菌特征分析讨论

2.3.2 样品中细菌特征分析讨论

第三章 菲降解菌的富集培养及分子鉴定

3.1 材料和方法

3.1.1 样品采集

3.1.2 实验试剂和设备

3.1.3 菲降解菌的富集培养

3.1.4 菲降解菌的固体平板初筛

3.1.5 菲降解产物的HPLC检测

3.2 菲降解菌群结构分子鉴定

3.2.1 菲降解菌DNA的提取

3.2.2 菲降解菌DNA的PCR扩增

3.2.3 荧光定量及Miseq测序

3.2.4 OTU生成及归类统计

3.2.5 菌群结构组成分析

3.2.6 多样性指数分析

3.2.7 主成分分析

3.3 结果及分析

3.3.1 菲降解菌的分离结果

3.3.2 菲降解菌的高效液相检测

3.3.3 DNA的扩增及检测

3.3.4 Miseq测序及序列优化

3.3.5 OTU分布统计及构建稀释性曲线

3.3.6 不同分类水平上的菌群结构组成分析

3.3.7 多样性指数分析

3.3.8 PCA分析

3.4 讨论

第四章 结论与展望

4.1 结论

4.2 展望

参考文献

附件：部分实验照片

致谢

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