枯草芽孢杆菌拮抗病原菌入侵宿主细胞机制的研究

摘要

病原菌作用于宿主细胞主要是通过粘附、激活信号转导通路和改变细胞骨架的结构达到感染宿主细胞的目的.枯草芽孢杆菌是常用的益生菌,近年来发现枯草芽胞杆菌对动物的病原菌也有拮抗作用,但对其拮抗病原菌的作用机制知道的较少.本试验对枯草芽孢杆菌拮抗病原菌入侵宿主细胞的机制进行研究,主要从下列四个方面展开:
　　 1.枯草芽孢杆菌拮抗病原菌粘附和入侵Caco-2细胞的研究
　　 本试验将产肠毒素大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌与枯草芽孢杆菌及其培养上清液分先后加到Caco-2细胞上,用活菌计数的方法来观察产肠毒素大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌及枯草芽孢杆菌粘附Caco-2细胞的数量.结果显示在排斥、竞争和置换试验中,枯草芽孢杆菌的菌体均能够明显抑制产肠毒素大肠杆菌的粘附、鼠伤寒沙门氏菌的粘附及内化；但是枯草芽孢杆菌的培养上清液只有在竞争试验中才能够明显抑制产肠毒素大肠杆菌的粘附、鼠伤寒沙门氏菌的粘附及内化.提示枯草芽孢杆菌通过与病原菌竞争粘附位点来抑制病原菌对Caco-2细胞的粘附和入侵。
　　 2.枯草芽孢杆菌拮抗病原菌对Caco-2细胞微丝的研究
　　 本试验用异硫氰酸荧光素-鬼笔环肽标记细胞微丝,在倒置荧光显微镜下观察细胞微丝的变化；利用Western blotting检测细胞微丝调节蛋白Rac1蛋白的表达变化.结果显示正常Caco-2细胞内微丝呈散在的平行排列；加鼠伤寒沙门氏菌后微丝呈小区域聚集；加产肠毒素大肠杆菌后,细胞微丝重排聚集在细胞中央放射状分布或分布紊乱；单独加枯草芽孢杆菌后,细胞微丝排列方式变化不大:同时分别加两种病原菌和枯草芽孢杆菌或其培养上清液后,大部分的细胞内微丝排列整齐,只是在少部分细胞内存在微丝的聚集。产肠毒素大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌可使细胞微丝调节蛋白Rac1的表达显著上调,而枯草芽孢杆菌及其培养上清液可以抑制病原菌对Rac1的影响。本试验证明产肠毒素大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌可影响细胞微丝的表达和分布；而枯草芽孢杆菌及其培养上清液可抑制病原菌的这种破坏作用.
　　 3.枯草芽孢杆菌拮抗病原菌对Caco-2细胞MAPKs信号通路的研究
　　 本试验用利用RT-PCR检测MAPK(ERK、p38和JNK)基因水平的变化,用western blotting检测MAPK蛋白磷酸化的变化。结果显示,产肠毒素大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌不会引起MAPKs信号通路中ERK2、p38和JNK1基因水平的变化。感染鼠伤寒沙门氏菌后Caco-2细胞内ERK、p38和JNK蛋白磷酸化水平显著上调,而感染产肠毒素大肠杆菌后细胞内ERK和p38蛋白磷酸化水平显著上调,而枯草芽孢杆菌能够抑制病原菌诱导的细胞MAPKs信号通路的活化.提示枯草芽孢杆菌可以抑制鼠伤寒沙门氏菌、产肠毒素大肠杆菌诱导的caco-2细胞MAPKs信号通路的活化作用,从而减少细胞的增殖,进而减少病原菌的感染。
　　 4.枯草芽孢杆菌拮抗大肠杆菌对猪肠道上皮的影响
　　 前三个试验利用cago-2细胞为体外模型研究了枯草芽孢杆菌拮抗产肠毒素大肠杆菌的作用机制,本试验用枯草芽孢杆菌饲喂仔猪,用组织学的方法观察枯草芽孢杆菌拮抗产肠毒素大肠杆菌对猪肠道上皮形态的影响.给初生仔猪在0、7、14、26日龄灌服枯草芽孢杆菌,断奶后用产肠毒素大肠杆菌K88进行攻毒,取十二指肠、空肠、回肠和结肠进行HE染色.只饲喂大肠杆菌的仔猪的十二指肠、空肠肠上皮细胞排列整齐；回肠肠上皮变薄,固有膜内细胞凌乱,有些细胞变性坏死；结肠肠黏膜上皮变性、坏死,细胞界限不清,有些细胞几乎完全破坏脱落,固有膜中大量炎性细胞进入肠腔.先饲喂枯草芽孢杆菌再饲喂大肠杆菌,十二指肠、空肠、回肠和结肠的上皮细胞均排列整齐,无炎性细胞浸润.提示在仔猪体内,枯草芽孢杆菌可以拮抗产肠毒素大肠杆菌K88对仔猪肠上皮的破坏.