嗜酸乳酸杆菌S-层蛋白拮抗肠道病原菌粘附或入侵宿主细胞机制的研究

摘要

S-层蛋白( S-layer protein)是乳酸杆菌表面的一层蛋白分子，近年来发现该蛋白对肠道病原菌具有拮抗作用。肠道病原菌主要是通过粘附或入侵、诱导细胞骨架重排和信号转导通路、影响细胞凋亡达到入侵宿主上皮细胞的目的．拮抗和阻止病原茵的粘附及入侵作用是保护细胞免受感染的有效方法。本研究旨在探讨乳酸杆菌S-层蛋白拮抗肠道病原菌的作用机制。首先提取和纯化嗜酸乳酸杆菌的S-层蛋白，研究S-层蛋白对肠道病原菌的拮抗作用；然后应用人结肠腺癌细胞系（Caco-2细胞）作为体外模型，检测S-层蛋白拮抗鼠伤寒沙门氏菌粘附及入侵Caco-2细胞的影响，包括细菌的粘附入侵、细胞骨架的变化、信号转导通路和细胞凋亡中几种因子的变化等，以期揭示乳酸杆菌S-层蛋白拮抗肠道病原菌粘附或入侵宿主细胞机制．主要分为以下五个试验：试验一：嗜酸乳酸杆菌S-层蛋白的提取纯化
　　 本试验应用已知具有S-层蛋白的嗜酸乳酸杆菌ATCC4356作为对照，从蛋白和基因两个水平对36株猪十二肠分离得到的乳酸杆菌进行S-层蛋白菌株筛选，然后提取纯化S-层蛋白并制备抗血清。结果显示：36株乳酸杆菌均不存在S-层蛋白．本试验提取纯化得到嗜酸乳酸杆菌的S-层蛋白，应用该S-层蛋白接种新西兰兔，制备得到S-层蛋白抗血清，琼扩效价为1：16。本试验表明乳酸杆菌S-层蛋白只存在于某些菌株中。试验二：嗜酸乳酸杆菌S-层蛋白对肠道病原菌粘附或入侵的拮抗作用
　　 首先应用三种不同的粘附试验：竞争试验( competition assay)、排斥试验(exclusionassay)和置换试验(displacement assay)，分别研究S-层蛋白对产肠毒素大肠杆菌K88和鼠伤寒沙门氏菌SL1344粘附或入侵Caco-2细胞的拮抗作用，然后应用Dot-blot方法检测S-层蛋白与两种细菌及Caco-2细胞的结合。结果显示：S-层蛋白能够显著协同产肠毒素大肠杆菌对Caco-2细胞的粘附．排斥试验和竞争试验的相对粘附力分别为452.30％±2.26%（P<0.01）和155.57%±5.81%(P<0.05)．S-层蚕白在排斥试验中，对产肠毒素大肠杆菌的协同粘附高于竞争试验。嗜酸乳酸杆菌也表现出明显的协同产肠毒素大肠杆菌粘附的效应．相反，S-层蛋白则能显著地拮抗鼠伤寒沙门氏菌的粘附及入侵。在竞争、排斥、置换三种粘附试验中，S-层蛋白可显著降低鼠伤寒沙门氏菌的粘附，其相对粘附力分别为1.17%±5.97%、8.71%±1.36%，10.56%±0.92%，差异极显著（P<0.01），其中竞争试验效果最好；并且S-层蛋白对鼠伤寒沙门氏菌粘附拮抗作用极显著高于嗜酸乳酸杆菌(P<0.01)；此外，S-层蛋白也能显著拮抗鼠伤寒沙门氏菌入侵。Dot-blot显示，S-层蛋白均可在两种细菌和Caco-2细胞表面自我组装。本试验表明，S-层蛋白协同增加产肠毒素性大肠杆菌对Caco-2细胞的粘附；却可显著拮抗鼠伤寒沙门氏菌对Caco-2细胞的粘附及入侵。S-层蛋白可能通过与鼠伤寒沙门氏菌竞争粘附受体，修饰细菌或Caco-2细胞表面相关结构介导拮抗作用．试验三：嗜酸乳酸杆菌S-层蛋白拮抗鼠伤寒沙门氏菌对细胞骨架的研究
　　 鼠伤寒沙门氏菌粘附或入侵宿主细胞过程中可显著引起细胞骨架变化。在试验二的基础上，本试验首先研究S-层蛋白对鼠伤寒沙门氏菌SL1344感染Caco-2细胞微线毛和上皮完整性的变化；然后研究S-层蛋白抗感染过程中对Caco-2细胞微丝分布及其微丝相关调节蛋白Racl表达的影响．结果显示：鼠伤寒沙门氏菌感染Caeo-2细胞后，可引起上皮细胞微绒毛变短，细胞微丝排列紊乱，细胞跨膜电阻下降。嗜酸乳酸杆菌S-层蛋白则能够拮抗鼠伤寒沙门氏菌对细胞微丝骨架的改变，并可减少鼠伤寒沙门氏菌引起Caco-2细胞跨膜电阻的破坏。鼠伤寒沙门氏菌可使Caco-2细胞Racl蛋白的表达量显著升高（0.39-0.02 VS0.15-0.01；P<0.001），而S-层蛋白则可极显著上调感染鼠伤寒沙门氏菌后Caco-2细胞Rael蛋白的表达(0.58+0.01 VS0.39-0.02;P<0.01)．本试验表明嗜酸乳酸杆菌S-层蛋白可能通过拮抗鼠伤寒沙门氏菌对细胞微绒毛和微丝骨架的破坏；上调Rae1蛋白表达来拮抗鼠伤寒沙门氏茵的粘附及入侵。试验四：嗜酸乳酸杆菌S-层蛋白拮抗鼠伤寒沙门氏菌对细胞MAPK信号通路的研究
　　 丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）信号通路对病原菌的防御发挥重要作用。本试验研究了S-层蛋白拮抗鼠伤寒沙门氏菌SL1344过程中对Caco-2细胞MAPK信号通路三种重要亚族ERK、JNK和p38的影响。结果显示：鼠伤寒沙门氏菌感染Caco-2细胞后，ERKl/2(0.34±0.02 VS0.04±0.01；P<0.001)、JNK(1.77±0.19 VS0.88±0.10; P<0.01)和p38(0.93±0.07 VS0.72±0.02;P<0.05)的磷酸化水平均显著升高。S-层蛋白可明显增加Caco-2细胞ERKl/2的磷酸化(0.54±0.04;P<0.001)，而不影响JNK与p38的活化。当S-层蛋白与鼠伤寒沙门氏菌共孵育后，细胞ERK1/2磷酸化水平(0.12±0.01)极显著低于分别单独作用细胞后的水平(P<0.001)，并且S-层蛋白可以显著拮抗鼠伤寒沙门氏菌对Caeo-2细胞JNK(0.64±0.05 VS1.77±0.19;P<0.01)和p38(0.61±0.04 VS0.93±0.07;P<0.05)的磷酸化。本研究表明S-层蛋白可能阻断细菌对MAPK信号通路的活化发挥拮抗鼠伤寒沙门氏菌的作用。试验五：嗜酸乳酸杆菌S-层蛋白拮抗鼠伤寒沙门氏菌对细胞凋亡的研究
　　 病原菌可诱导上皮细胞凋亡，主要表现为推迟凋亡时间，引起凋亡损伤，本试验首先研究鼠伤寒沙门氏菌引起Caco-2细胞凋亡的途径；然后研究嗜酸乳酸杆菌S-层蛋白拮抗鼠伤寒沙门氏菌感染引起细胞凋亡的机理。结果显示：鼠伤寒沙门氏菌显著诱导Caco-2细胞的凋亡造成损伤。鼠伤寒沙门氏菌诱导Caco-2细胞凋亡并不激活Caspase-1，而是显著诱导Caspase-3的活化。S．层蛋白能够拮抗鼠伤寒沙门氏菌对Caco-2细胞凋亡引起的感染损伤。我们发现，S-层蛋白可以抑制Caco-2细胞Caspase-3的活化．本试验表明：鼠伤寒沙门氏菌是通过激活Caspase-3介导Caco-2细胞凋亡．S．层蛋白抑制Caspase-3的活化与试验四中S-层蛋白激活ERKl/2信号通路相符．嗜酸乳酸杆菌S．层蛋白可能通过抑制Caspase-3活性、激活ERKl/2信号通路，共同介导拮抗鼠伤寒沙门氏菌引起的细胞凋亡损伤。