卷曲乳酸杆菌ZJ001 S-层蛋白基因结构及其表达产物的粘附和锚定功能研究

摘要

乳酸杆菌是人和动物消化道和生殖道中的正常微生物菌群之一,可通过生物拮抗、改善菌群生态平衡和提高机体免疫功能等方面在动物生产中发挥其益生素作用。S-层蛋白(S-layer protein)是许多细菌表面的主要蛋白成分,分子量为40-200 kDa,占菌体总蛋白的10-15％,一般为弱酸性(pI为4-6)。乳酸杆菌S-层蛋白是目前最小的已知S-层蛋白,分子量在25-71 kDa之间,为碱性(pI＞9)。只有少数乳酸杆菌S-层蛋白的结构已经清楚,但大部分功能尚不清楚。国内对于乳酸杆菌S-层蛋白基因的表达、蛋白功能及应用等方面鲜见报道。本研究通过系列体外试验探讨了猪肠道分离株卷曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)ZJ001的益生素样作用、编码S-层蛋白的基因结构以及与细菌细胞锚定和宿主细胞粘附功能相关的S-层蛋白功能域。
　　 L.crispatus ZJ001对强酸和胆汁具有较强的抵抗力,对HeLa细胞的粘附力、对鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和大肠杆菌(Escherichia coli)O157:H7体外生长和粘附力的拮抗作用与参考菌株ATCC4356相比更强。ZJ001株对S.typhimurium和E coli O157:H7体外生长的抑制作用主要是由于分泌大量乳酸等酸性物质导致培养环境的pH下降所引起。ZJ001株对S.typhimurium和E.coli O157:H7粘附力的拮抗作用则与它的强粘附能力相关,其对HeLa细胞的粘附率为88.9％,显著高于ATCC4356的15.0％(P＜0.01)。这些结果表明L.crispatusZJ001可作为益生素菌株而应用于预防肠道疾病。
　　 L.crispatus ZJ001表面存在约42kDa的S-层蛋白,该蛋白可用盐酸胍和LiCl处理获得,并对蛋白酶K敏感,细菌连续传代不影响该蛋白的表达。利用LiCl除去后,培养8 h左右又能在细菌表面重新形成。LiCl除去S-层蛋白后,ZJ001株的自凝现象和对HeLa细胞的粘附力降低,而抗S-层蛋白多克隆抗体对ZJ001株粘附力的抑制作用进一步证明了S-层蛋白在粘附过程中的重要性。ZJ001株能竞争和排除地抑制S.typhimurium和E.coli O157:H7对HeLa细胞的粘附力,但不能显著置换已粘附到细胞上的病原菌。LiCl除去S-层蛋白后,ZJ001对病原菌粘附力的拮抗作用降低,对E.coli O157:H7拮抗作用的影响更为明显。此外,S-层蛋白对E.coli O157:H7粘附力的拮抗作用比对S.typhimurium更强,100μg S-层蛋白对E.coli O157:H7与HeLa细胞的粘附力降低幅度可达87％,但对S.typhimurium的抑制率仅为21.2％。以上结果表明S-层蛋白参与了L.crispatusZJ001的粘附过程,并能拮抗病原菌的粘附。
　　 L.crispatus ZJ001具有两个S-层蛋白基因slpA和slpB,这两个基因编码的蛋白都具有乳酸杆菌S-层蛋白的典型特征。slpA基因全长1329bp,编码442个氨基酸残基,其中N端的30个氨基酸为信号肽序列。slpA成熟蛋白的分子量为44.3kDa,等电点为9.57。slpB基因全长1386bp,编码461个氨基酸残基,其中N端30个氨基酸也为信号肽序列。slpB成熟蛋白的分子量为45.1kDa,等电点为9.57。slpA和slpB成熟蛋白的氨基酸组成和含量很相似,疏水性氨基酸、带电荷的氨基酸和极性氨基酸含量都很高,但都没有含硫的氨基酸残基。二级结构预测结果表明slpA蛋白由37％的α-螺旋和49.7％的β-折叠组成,而slpB由27.9％的α-螺旋和58.9％的β-折叠组成。两个成熟蛋白的氨基酸同源性为47％,其中C端同源性高达87％,但N端和中间区域的同源性却只有30％,与其他乳酸杆菌S-层蛋白的同源性也集中在C端(77-95％之间),N端的变异较大。其中slpA蛋白与L.crispatus JCM5810 CbsA蛋白的同源性最高(82％)。Western blot和间接ELISA结果表明slpA和slpB之间存在交叉反应。与从ZJ001株表面提取的S-层蛋白不同,slpA的E.coli表达产物自身装配成片状的类结晶结构,slpB却形成了圆盘样结构。尽管slpA和slpB两个蛋白的结构不同,但均能粘附HeLa细胞。
　　 长距离PCR和序列分析结果表明slpA和slpB位于长约9.0kb的slp片段上,间隔约为4.5kb。只有slpA基因上游有一启动子结构,而slpB基因为反向序列且上游没有启动子结构。RT-PCR、Western blot和间接ELISA结果进一步证明了只有slpA在L.crispatus ZJ001中得到了转录和表达,并在细菌表面形成了S-层结构。slpA和slpB基因在5’端存在同源区,slpB基因可能通过位置的互换而转换到slpA启动子的下游,并且这一现象已在L.acidophilus ATCC4356中得到了证实。L.crispatus ZJ001在需氧和厌氧环境中形成三种不同的菌落形态,即粗糙型、光滑型和扁平型,但这三种菌落中,都没有发现slpA和slpB基因位置颠换的情况,RT-PCR只能检测到slpA基因的转录,而SDS-PAGE电泳发现这三种不同类型菌落的细菌表面都存在S-层蛋白。以上结果表明,培养环境中的氧浓度不能引起slpA和slpB基因位置的颠换,也不能诱导slpB的转录表达。
　　 根据氨基酸组成和同源性分析,L.crispatus ZJ001 slpA蛋白具有两个不同的结构域,即SAN和SAC,其中SAN(1-290aa)由亲水性和疏水性氨基酸交替组成,而SAC(291-412aa)主要由亲水性氨基酸组成,且碱性氨基酸的含量也很高。为了进一步阐明SAN和SAC的功能,将它们分别和eGFP进行融合表达和纯化,结果表明:SAN-eGFP能和抗S.层蛋白多克隆抗体反应,并能粘附到HeLa细胞表面:eGFP-SAC与抗S-层蛋白多克隆抗体的反应较弱,能锚定到经LiCl除去S-层蛋白后的L.crispatus ZJ001和L.acidophilus ATCC4356的细胞外膜上,并能锚定到干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei)M4的细胞壁上,但不能锚定未经处理的L.crispatus ZJ001和L.acidophilus ATCC4356以及约氏乳酸杆菌(Lactobacillus johnsonii)R20的细胞外膜上。以上结果表明SAN与slpA蛋白对宿主细胞的粘附作用有关,而SAC主要参与slpA蛋白在L.crispatus ZJ001外膜上的锚定。
　　 本试验结果为深入探索乳酸杆菌ZJ001株S-层蛋白的结构与功能及其作为基因工程疫苗载体的研究奠定了良好基础。