人的细胞间粘附分子－1膜外I－Ⅲ功能区基因表达产物及其制备方法和该产物在放免技术中的应用

摘要

本发明公开了一种人的细胞间粘附分子－1膜外I－III功能区基因表达产物及其制备方法和该产物在放免技术中的应用，属于基因工程技术领域。将ICAM－1膜外I－III功能区编码基因重组到表达型质粒pET42a中，并将其转化入原核表达菌中，纯化获得表达产物GST－ICAM－1；以此作为抗原，免疫家兔后获得兔抗人的多克隆抗体。这样制备的人的细胞间粘附分子－1膜外I－III功能区基因在原核系统的中表达产物较真核系操作简便，更易于纯化，价格便宜，产率高。在国内外率先研制出人血清sICAM－1放射免疫分析技术，并初步应用于临床检测，对于判断Graves’病的疗效、停药和复发具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体是一种人的细胞间粘附分子-1膜外I-III功能区基因表达产物及其制备方法和该产物在放免技术中的应用。

背景技术

自身免疫性甲状腺疾病，是一个多发病，包括Graves’病(GD)、慢性淋巴性甲状腺炎(HT)等，其发病机理至今尚未完全明了。近年研究表明细胞间粘附分子-1(intracellular adhesion molecule-1，ICAM-1)与其发病密切相关。细胞间粘附分子是指一群在细胞表面表达具有细胞间粘附作用的糖蛋白物质，它们参与细胞与细胞、细胞与细胞外基质相互识别、相互粘着、信号传递及转移、免疫细胞相互识别和相互作用，白细胞的再循环和迁移等功能。20世纪90年代初期Frank Schuppert等人应用Northern印渍技术发现在自身免疫性甲状腺炎患者中有ICAM-1表达，而正常人表达甚低或不表达。Mirazaki，Monica M等用免疫组化技术发现GD和HT患者甲状腺滤泡上皮细胞和甲状腺血管内皮细胞都有ICAM-1表达。

Graves’病是一种常见的自身免疫性甲状腺疾病，TRAb的出现为其临床特征。由于Graves’病是一种慢性病，在治疗过程中，以往多根据自身抗体的变化来评价治疗效果，以增、减药物或者停药。

目前认为由于甲状腺自身抗体会导致产生甲状腺内的自身免疫性炎症，在该部位会出现淋巴细胞的浸润，而T淋巴细胞的定位到自身免疫性炎症部位与内皮细胞，靶细胞的粘附，T细胞与B细胞及抗原递呈细胞的相互作用等免疫过程中ICAM-1/LFA-1粘附系统起着重要作用。

粘附分子(adhesion molecules)是指由细胞产生存在于细胞表面介导细胞的细胞间或细胞与苍质间相互接触和结合的一类分子。1993年第五届人白细胞分化抗原国际专题讨论会上，已将粘附分子单独列为一组新抗原。根据结构分为四类，即粘合素超家族、免疫球蛋白超家族、selectin家族和Cadherin家族。

细胞间粘附分子-1是最早发现的免疫球蛋白超家族粘附分子之一，是位细胞表面的单链糖蛋白，ICAM-1分子量为80-115KD。在细胞膜上分细胞外段、跨膜区段和细胞内段。ICAM-1的mRNA含1846个碱基，编码532个氨基酸。1988年Donald，E.S等报道编码的532个氨基酸中含有27个氨基酸的信号态和505个氨基酸的ICAM-1蛋白，其中1-453编码，细胞外区的分1-5细胞外免疫球蛋白样结构区，分别为1-88，89-185，186-284，285-385，386-483。其中第一个免疫球蛋白样结构区与淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)配基相结合，参与抗原识别；第三个免疫球蛋白样结构区与补体受体3(Mac-1)相结合。ICAM-1分布广泛如血管内皮细胞、胸腺上皮细胞、纤维母细胞、多种肿瘤细胞以及甲状腺上皮细胞等。

可溶性细胞间粘附分子-1(s ICAM-1)为细胞表面ICAM-1脱落所形成的可溶形式，分子量约为80KD，正常人血清浓度为100-200ng/ml，sICAM-1与ICAM-1同样具有LFA-1结合功能

其异常表达是导致Graves’病发生的重要因素之一。与其它临床常用指标相比，Graves’病患者体内血清sICAM-1水平对于反映其疾病的状况则更为快速、灵敏，所以对于判断Graves’病的疗效、停药和复发具有重要意义。

目前，国内外并无ICAM-1的甲状腺提取物，而且国外经真核系统获取的ICAM-1基因工程产品价格昂贵。

发明内容

本发明为解决现有技术中，国内外尚无ICAM-1的甲状腺提取物，以及运用基因工程技术制备表达产物，并应用在临床检验中，而提出的人的细胞间粘附分子-1膜外I-III功能区基因表达产物及其制备方法和该产物在放免技术中的应用。

本发明是按以下技术方案实现的。

一种人的细胞间粘附分子-1膜外I-III功能区基因表达产物，该表达产物可以替代人的细胞间粘附分子-1全长的核苷酸序列，其重组蛋白具有免疫活性，其融合蛋白分子量为66.37kD，产率约为35mg/L培养基。

所述的功能区基因表达产物，其提取的重组质粒命名为ZpUCICAM，且其基因片段大小与所要克隆基因片段一致。

所述的功能区基因表达产物，其功能区基因表达载体的重组质粒命名为ZpET42aICM，且其接口序列、氨基酸读码框架为：CC ATG GGA TAT CGG    CAG ACA TCT GTG TCC CC    PET42a载体             目的基因。

一种人的细胞间粘附分子-1膜外I-III功能区基因表达产物的制备方法，是由Graves’病患者甲状腺组织中提取的总RNA，经RT-PCR合成并扩增出ICAM-1膜外I-III功能区编码基因，克隆入pUC18载体；将ICAM-1膜外I-III功能区编码基因重组到表达型质粒pET42a中，再将重组表达型质粒转化入原核表达菌中；在亲和纯化柱中，纯化获得表达产物GST-ICAM-1，复经亲和层析纯化，获取重组ICAM-1膜外I-III功能区融合蛋白GST-ICAM-1。

所述的表达产物的制备方法，其重组表达型质粒是转化入E.coli BL21表达菌中表达的。

所述的表达产物的制备方法，其重组表达型质粒转化入E.coliBL21表达菌中的表达条件为：以0.5-1％乳糖为诱导剂，20-37℃，诱导3-24小时。

所述的表达产物的制备方法，是将重组表达型质粒转化入E.coli BL21表达菌中的表达条件为：以IPTG0.1-1.0mM为诱导剂。

所述的表达产物的制备方法，是将ICAM-1膜外I-III功能区编码基因重组到表达型质粒PET28b中，再将重组表达型质粒转化入原核表达菌中。

所述的表达产物的制备方法，是将ICAM-1膜外I-III功能区编码基因重组到表达型质粒PGEX4T3中，再将重组表达型质粒转化入原核表达菌中。

人的细胞间粘附分子-1膜外I-III功能区基因表达产物在放免技术中的应用，是以表达产物GST-ICAM-1作为抗原，免疫家兔后获得兔抗人的多克隆抗体，再将兔抗人的多克隆抗体作为一抗用于人血清sICAM-1放射免疫分析技术中。

这样的人的细胞间粘附分子-1膜外I-III功能区基因表达产物在原核中的表达系统较真核系操作简便，成本较低，且表达产品易于纯化，所以使用原核表达系统获取表达产物GST-ICAM-1，进而以此作为抗原用于免疫家兔，在国内外率先研制出人血清sICAM-1放射免疫技术，并初步应用于临床检测，对于判断Graves’病的疗效、停药和复发具有重要意义。

附图说明

图1为RT-PCR扩增人ICAM-1膜外I-III功能区基因

图2为Bgl I酶切鉴定PCR产物

图3为HindIII单酶切鉴定重组质粒ZpUCICAM

图4为HindIII和EcoRI双酶切鉴定重组质粒ZpUCICAM

图5为PCR鉴定重组质粒ZpUCICAM

图6为接口序列图

图7为ZpET42aICAM表达载体不同条件下诱导表达

图8为IPTG与乳糖诱导表达的比较

图9为融合蛋白GST-ICAM-1纯化结果比较

图10为考马斯亮蓝蛋白定量法标准曲线

图11为重组蛋白GST-ICAM-1 Western Blot结果

具体实施方式

(一)、获取人ICAM-1膜外I-III功能区基因及其鉴定：

TRIzol法提取经手术切除的Graves病患者甲状腺组织总RNA，RT-PCR法合成并扩增人ICAM-1膜外I-III功能区基因，以100bp DNA梯度标准为核酸分子量标准，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物结果显示约868bp处可见一条清晰的电泳条带，与所要扩增的目的基因片段大小一致如图1，图中1 Bgl I酶切产物，2 100bp DNALadder。

Bgl I酶切PCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物结果，显示在505和363bp处可见清晰的两条电泳条带，与理论计算结果相符合如图2，图中1 Bgl I酶切产物，2 100bp DNA Ladder。

(二)、人ICAM-1膜外I-III功能区基因克隆及鉴定：

1、重组质粒ZpUCICAM酶切鉴定：

将人ICAM-1膜外I-III功能区基因插入到pUC18质粒载体，命名为ZpUCICAM，转导入DH5α菌中。碱裂解法提取重组质粒ZpUCICAM，以HindIII单酶切后，1％琼脂糖凝胶电泳显示约在3554bp处有一条清晰的电泳条带，而对照pUC18质粒在2686bp处如图3，图中1 HindIII酶切重组质粒ZpUCICAM，2 HindIII酶切pUC18质粒，3 15000DL DNA Marker。

HindIII和EcoRI双酶切鉴定结果显示在2631bp和923bp处出现两条电泳条带，而对照空pUC18质粒在2631bp处仅出现一条电泳条带，与理论计算结果相一致，如图4，图中1 HindIII、EcoRI双酶切重组质粒ZpUCICAM，2 HindIII、EcoRI双酶切pUC18质粒，3 15000DL DNA Marker。

2、重组质粒ZpUCICAM的PCR鉴定：

以ZpUCICAM为模板，PCR扩增人ICAM-1膜外I-III功能区基因，结果显示868bp处可见一条清晰的电泳条带，与所要克隆的目的基因片段大小一致，而对照空pUC18质粒无电泳条带，如图5，图中1PCR扩增pUC18产物，2 PCR扩增ZpUCICAM产物，3 200bp DNA Ladder。

3、重组质粒ZpUCICAM测序分析：

以纯化后重组质粒ZpUCICAM为模板，在CEQ2000型DNA序列分析仪对含人ICAM-1膜外I-III功能区基因的重组质粒进行序列测定，测定结果与Donald E.Staunton等报告的序列完全一致，见下：

ICAM-1 I-III功能区基因与氨基酸序列(852bp＝284aa)CAG ACA TCT GTG TCC CCC TCA AAA GTC ATC CTG CCC CGG GGA GGC TCC GTGGln Thr Ser Val Ser Pro Ser Lys Val Ile Leu Pro Arg Gly Gly Ser ValCTG GTG ACA TGC AGC ACC TCC TGT GAC CAG CCC AAG TTG TTG GGC ATA GAGLeu Val Thr Cys Ser Thr Ser Cys Asp Gln Pro Lys Leu Leu Gly Ile GluACC CCG TTG CCT AAA AAG GAG TTG CTC CTG CCT GGG AAC AAC CGG AAG GTGThr Pro Leu Pro Lys Lys Glu Leu Leu Leu Pro Gly Asn Asn Arg Lys ValTATGAA CTG AGC AAT GTG CAA GAA GAT AGC CAA CCA ATG TGC  TAT TCA AACTyr Glu Leu Ser Asn Val Gln Glu Asp Ser Gln Pro Met Cys Tyr Ser AsnTGC CCT GAT GGG CAG TCA ACA GCT AAA ACC TTC CTC ACC GTG TAC TGG ACTCys Pro Asp Gly Gln Ser Thr Ala Lys Thr Phe Leu Thr Val Tyr Trp ThrCCA GAA CGG GTG GAA CTG GCA CCC CTC CCC TCT TGG CAG CCA GTG GGC AAGPro Glu Arg Val Glu Leu Ala Pro Leu Pro ser Ttp Gln Pro Val Gly LysAAC CTT ACC CTA CGC TGC CAG GTG GAG GGT GGG GCA CCC CGG GCC AAC CTCAsn Leu Thr Leu Arg Cys Gln Val Glu Gly Gly Ala Pro Arg Ala Asn LeuACC GTG GTG CTG CTC CGT GGG GAG AAG GAG CTG AAA CGG GAG CCA GCT GTG Thr Val Val Leu Leu Arg Gly Glu Lys Glu Leu Lys Arg Glu Pro Ala ValGGG GAG CCC GCT GAG GTC ACG ACC ACG GTG CTG GTG AGG AGA GAT CAC CATGly Glu Pro Ala Glu Val Thr Thr Thr Val Leu Va1 Arg Ar Aspg His HisGGA GCC AAT TTC TCG TGC CGC ACT GAA CTG GAC CTG CGG CCC CAA GGG CTGGly Ala Asn Phe Ser Cys Arg Thr Glu Leu Asp Leu Arg Pro Gln Gly LeuGAG CTG TTT GAG AAC ACC TCG GCC CCC TAC CAG CTC CAG ACC TTT GTC CTGGlu Leu Phe Glu Asn Thr Ser Ala Pro Tyr Gln Leu Gln Thr Phe Val LeuCCA GCG ACT CCC CCA CAA CTT GTC AGC CCC CGG GTC CTA GAG GTG GAC ACGPro Ala Thr Pro Pro Gln Leu Val Ser Pro Arg Val Leu Glu Val Asp ThrCAG GGG ACC GTG GTC TGT TCC CTG GAC GGG CTG TTC CCA GTC TCG GAG GCCGln Gly Thr Val Val Cys Ser Leu Asp Gly Leu Phe Pro Val Ser Glu AlaCAG GTC CAC CTG GCA CTG GGG GAC CAG AGG TTG AAC CCC ACA GTC ACC TATGln Val His Leu Ala Leu Gly Asp Gln Arg Leu Asn Pro Thr Va Thr TyrlGGC AAC GAC TCC TTC TCG GCC AAG GCC TCA GTC AGT GTG ACC GCA GAG GACGly Asn Asp Ser Phe Ser Ala Lys Ala Ser Val Ser Val Thr Ala Glu AspGAG GGC ACC CAG CGG CTG ACG TGT GCA GTA ATA CTG GGG AAC CAG AGC CAGGlu Gly Thr Gln Arg Leu Thr Cys Ala Val Ile Leu Gly Asn Gln Ser GlnGAG ACA CTG CAG ACA GTG ACC ATC TAC AGC TTT CCGGlu Thr Leu Gln Thr Val Thr Ile Tyr Ser Phe Pro。

(三)、人ICAM-1膜外I-III功能区基因表达载体的构建及鉴定：

将人ICAM-1膜外I-III功能区基因插入表达质粒pET42a中，命名为ZpET42aICAM。

1、重组质粒ZpET42aICAM接口序列测序分析：

结果显示重组质粒ZpET42aICAM 5’-端接口序列完全正确，氨基酸读码框架正确，如图6，图中1为PET42a载体  23目的基因。

(四)、人ICAM-1膜外I-III功能区基因在大肠杆菌中的表达：

将ZpET42aICAM表达载体转化入E.coli BL21表达菌中，以乳糖为诱导剂进行诱导表达，同时以空菌，空质粒为对照。

表达条件为：以0.5％乳糖为诱导剂，20℃，诱导6小时。超声碎菌后取上清液上样，10％SDS-PAGE结果显示重组表达质粒转化E.coli BL21(DE3)在分子量约为64.79kD处有一明显加深的蛋白带，而空载体质粒在分子量约为35.09kD处有一蛋白带，空菌在两处均无蛋白带，如图7，图中

1. 1.0mM IPTG37℃诱导E.coli BL21(DE3)3小时碎菌上清

2. 1.0mM IPTG37℃诱导pET42a转化E.coli BL21(DE3)3小时碎菌上清

3. 1.0mM IPTG25℃诱导ZpET42aICAM转化E.coli BL21(DE3)3小时碎菌上清

4. 1.0mM IPTG30℃诱导ZpET42aICAM转化E.coli BL21(DE3)3小时碎菌上清

5. 1.0mM IPTG37℃诱导ZpET42aICAM转化E.coli BL21(DE3)3小时碎菌上清

6. 1.0mM IPTG37℃诱导E.coli BL21(DE3)pLysS 3小时碎菌上清

7. 1.0mM IPTG37℃诱导pET42a转化E.coli BL21(DE3)pLysS 3小时碎菌上清

8. 1.0mM IPTG25℃诱导ZpET42aICAM转化E.coli BL21(DE3)pLysS 3小时碎菌上清

9. 1.0mM IPTG30℃诱导ZpET42aICAM转化E.coli BL21(DE3)pLysS 3小时碎菌上清

10. 1.0mM IPTG37℃诱导ZpET42aICAM转化E.coli BL21(DE3)pLysS 3小时碎菌上清

11.低分子量蛋白标准。

(五).诱导剂IPTG与乳糖诱导表达的比较

ZpET42aICAM为最佳表达载体，以1.0mMIPTG为诱导剂，在最佳表达条件下，100ml 2-YT液体培养基中诱导表达，同时与以0.5％乳糖为诱导剂，诱导温度20℃，诱导时间分别为6小时及过夜比较目的蛋白的表达量。结果显示：1.0mMIPTG，5％乳糖诱导6小时和过夜碎菌上清目的蛋白占总体蛋白含量分别为26.71％，41.61％和42.20％。如图8，图中

1. 0.5％乳糖诱导过夜碎菌沉淀

2. 0.5％乳糖诱导过夜碎菌上清

3. 0.5％乳糖诱导6小时碎菌沉淀

4. 0.5％乳糖诱导6小时碎菌上清

5. 1.0mMIPTG诱导3小时碎菌沉淀

6. 1.0mMIPTG诱导3小时碎菌上清。

(六)、重组人ICAM-1膜外I-III功能区基因表达产物的纯化与鉴定：

1.融合蛋白的纯化

超声碎菌后的上清液分别以His.Tag融合蛋白的纯化系统和GST.Tag融合蛋白的纯化系统纯化融合蛋白GST-ICAM-1，10％SDS-PAGE结果显示：两种纯化系统均能在64.79kD处可见一条清晰蛋白条带，但是GST.Tag融合蛋白的纯化系统还存在其它两条蛋白条带，如图9，图中1 GST.Tag融合蛋白纯化系统纯化融合蛋白GST-ICAM-1，2.His.Tag融合蛋白纯化系统纯化融合蛋白GST-ICAM-1，3.低分子量蛋白标准。

经比较后决定采用His.Tag融合蛋白的纯化系统。

2、表达产物的鉴定

(1)、分子量的测定：

根据低分子量蛋白标准的各个条带的分子量及其相对迁移率，建立Rf与LgMW的直线回归方程，将融合蛋白的Rf值代入此回归方程，算得融合蛋白分子量为66.37kD。

(2)、蛋白定量：

考马斯亮蓝染料与蛋白质结合后在595nm处存在紫外吸收峰。His.Tag融合蛋白的纯化系统纯化所得蛋白，酶标仪根据OD值可自动计算蛋白浓度，标准曲线如图10。融合蛋白的浓度为35mg/L左右。折算成蛋白产量，融合蛋白约为35mg/L培养基。

(3)、免疫学活性的鉴定：

纯化重组GST-ICAM-1从SDS-PAGE上电转移至硝酸纤维素膜上完全，经Western Blot证实重组蛋白具有免疫活性。如图11，图中1.GST对照，2.重组蛋白GST-ICAM-1，3.低分子量蛋白标准。

(七)、重组蛋白GST-ICAM-1在临床检测中的初步应用：

用GST-ICAM-1免疫家兔，制备抗体，作为人血清sICAM-1放射免疫方法中的抗体，初步应用于临床检测。检测结果显示：治疗前Graves’病组、药物治疗后甲状腺功能恢复正常的Graves’病组血清sICAM-1明显高于正常组(P＜0.01)，而单纯性甲状腺肿大患者组与正常组无蒸异(P＞0.05)；治疗前Graves’病组明显高于药物治疗后甲状腺功能恢复正常的Graves’病组(P＜0.05)；Graves’病患者在甲状腺次全切除前后、¹³¹I治疗前后及抗甲状腺药物治疗前后，经自身配对t检验表明血清sICAM-1明显降低(P＜0.05)；Graves’病停药复发患者组血清sICAM-1明显高于甲状腺功能恢复正常的Graves’病患者组(P＜0.01)。