光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP914结构对抗冻活性的影响

摘要

本研究采用实验室前期获得的新疆荒漠甲虫光滑鳖甲Anatolica polita抗冻蛋白基因ApAFP914，构建不同的原核表达质粒，获得了具有不同标签的重组光滑鳖甲抗冻蛋白 ApAFPs。以 ApAFP914作为蓝本，通过定点突变技术获得了ApAFP914-A19T、ApAFP914-T33F和ApAFP914-T33&45F三个突变体基因。经ExPAsy的Swiss Model生物信息学软件预测野生型与突变体蛋白的高级结构，结果表明带有突变位点的基因在空间结构上变化并不大，位点的改变并没有影响蛋白质的结构。
　　将构建好的pET32a-ApAFP914及其突变体在E. coliBL21(DE3)菌株中高效表达可溶性的融合蛋白TrxA-ApAFP914，Ni-NTA亲和层析纯化后纯度达到95％以上，SDS-PAGE检测其分子量约为30 kDa，Western Blot检测具有活性。
　　采用差示扫描量热仪（DSC）分析重组ApAFP914及其突变体的量热学特性并对其热滞活性（THA）进行了测定。ApAFP914s的THA测定值与溶液中冰核含量有关。当ApAFP914s溶液冰核含量小于25%时，能够观察到明显的重结晶延滞现象，即当温度降到熔点温度以下溶液才开始结冰，表明ApAFP914s具有热滞效应。当溶液冰核含量小于5%时，ApAFP914的THA可达到0.49℃，而ApAFP914-A19T则高达0.55℃，ApAFP914-T33F降低为0.38℃，ApAFP914-T33&45F的0.31℃则更低。ApAFP914s的THA随蛋白浓度的增加而变大，具有明显的浓度效应。通过比较热滞活性（THA）3种突变体和ApAFP914，顺序是ApAFP914-A19T> ApAFP914> ApAFP914-T33F＞ApAFP914-T33&45F。
　　ApAFPs对菌体的体外低温保护实验结果表明，ApAFP914可明显提高大肠杆菌和酵母菌在低温下的存活率，且具有明显的时间效应和浓度效应。相同摩尔浓度下， ApAFP914及其突变体对菌体的保护效果顺序是 ApAFP914-A19T≈ApAFP914> ApAFP914-T33F≈ApAFP914-T33&45F。
　　ApAFP914也可显著降低4℃、-4℃或-7℃低温条件下红细胞的溶血率。初步推测ApAFP914通过与冰核吸附结合阻止冰晶的生长，同时与红细胞膜结合保护膜完整性而发挥低温保护作用。
　　用DSC法测定了盐溶液NaCl、LiCl、CaCl2、MgCl2及多羟基醇类物质山梨醇、海藻糖对重组光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP914热滞活性的影响。发现盐离子可明显依数性地增加重组ApAFP914的热滞活性，且二价盐离子溶液的增效作用大于一价盐离子，在低浓度条件下尤为明显。两种多羟基物质的增效作用小于盐离子作用，需在高浓度下才表现出明显的增效作用。
　　本研究还探究了 ApAFP914作为外源添加剂对小鼠卵母细胞玻璃化冷冻的影响。通过形态观察及FDA、PI双染色技术统计添加ApAFP914后小鼠卵母细胞玻璃化冷冻后的存活率。结果发现ApAFP914处理组卵母细胞的存活率显著高于对照组，说明ApAFP914可考虑作为卵母细胞玻璃化冷冻添加剂使用。

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第一部分 文献综述

1 昆虫如何应对寒冷环境

2 抗冻蛋白对生物体的重要意义

3 抗冻蛋白的分类

4 昆虫抗冻蛋白的结构

5 抗冻蛋白的作用原理

5.1抗冻蛋白与冰晶的相互作用

5.2抗冻蛋白与细胞的相互作用

6 抗冻蛋白抗冻效果的影响因素

7 抗冻蛋白在细胞低温保护领域的研究进展

7.1细胞玻璃化冷冻的原理

7.2常见的细胞冷冻保护剂与抗冻蛋白的比较

7.3抗冻蛋白在细胞保存中的应用

8 展望

参考文献

第二部分 实验部分

第一章光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP914 TXT基序对抗冻活性的影响

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

参考文献

第二章 小分子增效剂对光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP914的活性增强作用

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

参考文献

第三章 光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP914对小鼠卵母细胞的玻璃化冷冻保护活性分析

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

参考文献

第三部分 结论与展望

第四部分 附录

附录1 英文缩略语

附录2 主要实验仪器

致谢

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