光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP914重复序列增加与其抗冻活性关系的研究

摘要

光滑鳖甲（Anatolica polita）属拟步甲科，生活于新疆古尔班通古特沙漠。本实验前期在光滑鳖甲体内发现多个抗冻蛋白基因，其中ApAFP914蛋白结构中具有7个规则重复序列，且每个重复序列中都具有与冰晶结合的Thr-X-Thr基序，然而TXT基序数变化与ApAFP914抗冻活性之间的关系还有待于进一步研究。
　　本研究以光滑鳖甲抗冻蛋白基因ApAFP914为实验材料，通过合成构建的方法对ApAFP914进行序列改造，分别获得具有5重复序列的ApAFP914-S，具有8重复序列的ApAFP914-C，具有10重复序列的ApAFP914-T并与具有7重复序列的ApAFP914在蛋白抗冻活性方面进行比较。
　　1.将测序鉴定正确的 pET32a-ApAFP914-S、pET32a-ApAFP914-C、pET32a-ApAFP914-T及实验室前期保存的pET32a、pET32a-ApAFP914转入大肠杆菌BL21（DE3）中进行原核表达并获得具有不同重复序列数的TrxA-ApAFP914s融合蛋白，亲和纯化后经SDS-PAGE电泳显示各融合蛋白均以可溶形式表达，分子量与预期大小一致且纯度较高。
　　2.采用差式扫描量热法对TrxA、具有不同重复序列数的TrxA-ApAFP914s融合蛋白及无关蛋白BSA进行热滞活性（THA）测定表明，TrxA及BSA不具有THA，而不同重复序列数的TrxA-ApAFP914s均具有不同的THA，且具有一定的浓度效应；在相同浓度下它们的THA大小依次为ApAFP914-C>ApAFP914=ApAFP914-T>ApAFP914-S。
　　3.在对大肠杆菌DH5α的低温冷冻保护实验中，外源添加具有不同重复序列数的TrxA-ApAFP914s及TrxA，可提高菌体的存活率，在50μg/mL浓度下，对菌体的低温保护效果依次为 ApAFP914-C>ApAFP914=ApAFP914-T>ApAFP914-S>TrxA>PBS。
　　4.小鼠卵母细胞玻璃化冷冻试验中，玻璃化液中添加终浓度为5μg/mL的TrxA、TrxA-ApAFP914-C及TrxA-ApAFP914，结果显示ApAFP914-C及ApAFP914均能提高小鼠卵母细胞玻璃化冻存后的存活率。检测玻璃化冷冻后卵母细胞中sod1、mad2及eg5基因的相对表达量显示，在各玻璃化冻存处理组中均有显著上调（P<0.05）。

目录

第一部分 文献综述

1昆虫抗冻蛋白的类型

1.1 赤翅甲、黄粉虫、小胸鳖甲、光滑鳖甲（鞘翅目拟步甲科）

1.2 松皮天牛抗冻蛋白（鞘翅目天牛科）

1.3 云杉卷叶蛾抗冻蛋白、尺蠖抗冻蛋白（鳞翅目）

1.4 雪蚤（弹尾目）

2昆虫抗冻蛋白的结构与THA

3抗冻蛋白与细胞膜的相互作用

4抗冻蛋白与冰晶的相互作用

5抗冻蛋白对卵母细胞玻璃化冷冻的影响

5.1玻璃化冷冻对卵母细胞的影响

5.2抗冻蛋白在细胞玻璃化冻存中的作用

6昆虫抗冻蛋白的其他作用

7展望

参考文献

第二部分 实验部分

1材料方法

2结果

3讨论

参考文献

第二章 光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP914及ApAFP914-C在小鼠卵母细胞玻璃化冷冻中的作用

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

第三部分 结论与展望

第四部分 附录

常用仪器设备

个人简介

致谢

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