甘蓝型油菜种子中脂质分布研究和基于UPLC-TripleTOF脂质组分析方法的建立

摘要

植物油脂不仅为人体提供能量与营养，也是重要的工业原料。甘蓝型油菜(Brassica napus L.)是我国第一大油料作物，菜籽油是我国食用油的主要来源之一。近年来，食用植物油消费总量不断提高，提高油菜种子含油量是保障我国食用植物油供需平衡的关键因素。了解油菜种子油脂合成调控机制可以为油菜高油育种提供理论支持。
　　本研究从500余份油菜种质资源挑选出2个“双低”油菜材料中双11号(ZS11，高含油量)和WH5557（低含油量）并利用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)测定了不同发育阶段种子的脂肪酸含量及组成。结果表明，ZS11与WH5557成熟种子的含油量和脂肪酸组成具有明显差异，并且在种子发育过程中ZS11油脂积累速度显著快于WH5557。
　　利用基质辅助激光解吸电离质谱成像技术(MALDI-MSI)分析了成熟种子不同组织（外子叶、内子叶与胚根）中三酰甘油(TAG)与磷脂酰胆碱(PC)的含量与组成。结果显示，不同组织之间的TAG与PC的含量与组成存在显著差异，脂质分布具有空间分布差异性。同时通过电喷雾质谱串联质谱(ESI-MS/MS)分析了种子中的TAG及PC各组成成分的mol％,此结果与MALDI-MSI的结果总体一致，表明MALDI-MSI结果是可靠的。在显微镜下分离成熟种子的外子叶、内子叶及胚根并提取脂质，利用液相色谱电喷雾质谱串联质谱(LC-ESI-MS/MS)检测了种子各组织的脂质含量及组成成分。结果表明，不同组织中脂质含量与组成具有显著差异。此结果与MALDI-MSI结果一致，进一步验证了MALDI-MSI结果的可靠性。
　　收集发育34天的种子，提取种子不同组织的RNA并进行转录组测序。转录组数据表明，糖酵解、脂肪酸从头合成、TAG合成、脂滴形成等油脂代谢途径中多个关键基因的表达量均存在差异。以上结果表明，油脂合成过程中的关键基因的表达水平对不同种类脂质的空间分布起着一定的作用。而2个材料中蛋白质、可溶性糖及淀粉含量的差异则暗示了WH5557种子中的碳更倾向于积累到碳水化合物中，这可能是造成其含油量低的原因之一。
　　此外，为了更高效地分析油菜脂质代谢物，实现高通量脂质组分析，我们开发并建立了基于高分辨质谱UPLC-TripleTOF的脂质组高通量分析方法。相比于传统的脂质组分析方法，此方法具有高效、快速、样品需求量少和准确度高等特点。基于此方法，我们分析了ZS11的根、茎、叶、叶柄及发育中的种子的脂质含量及组成成分。结果表明，基于UPLC-TripleTOF的脂质组分析方法重复性良好，可以对甘油酯、磷脂和糖脂等13类脂（总计146个脂质分子）进行准确地定性与定量。油菜中不同器官及不同发育阶段种子的脂质组的测定为脂质组学的研究提供了参考依据。基于UPLC-TripleTOF的脂质组学分析方法可成为高通量脂质组分析的重要手段。

目录

声明

摘要

缩略词表

1．前言

1．1 植物中油脂合成途径

1．1．1 脂肪酸的合成

1．1．2 三酰甘油的合成

1．2 脂质组学的质谱研究方法

1．2．1 质谱技术在植物代谢领域中的应用

1．2．2 质谱技术在脂质组分析中的应用

1．3 植物种子中脂质分布研究

1．4 本研究的目的与意义

2．材料与方法

2．1 实验材料

2．2 田间取样

2．3 MALDI-MSI分析

2．4 油菜种子中PC与TAG的提取与ESI-MS分析

2．5 种子不同组织脂质的提取与LC-ESI-MS／MS分析

2．6 种子不同组织脂肪酸的提取与GC-MS分析

2．7 RNA提取、RNA-seq分析和real-time PCR

2．8 基于UPLC-TripleTOF的油菜脂质提取与分析方法

3．结果与分析

3．1 高、低含油量的甘蓝型油菜种子性状的比较

3．2 甘蓝型油菜种子中TAG与PC分布

3．2．2 PC在油菜种子中的分布

3．3 基于LC-ESI-MS／MS的油菜种子脂质组分析

3．4 高、低含油量油菜种子中各组织的基因表达

3．5 影响种子脂质分布差异与含油量的因素

3．6 基于UPLC-TripleTOF的脂质组分析方法的建立

4．讨论

4．1 油菜种子TAG含量的不同

4．2 油菜种子中脂质的不同分布

4．3 基于UPLC-TripleTOF高通量脂质组分析方法

参考文献

附录

致谢