黄瓜白果皮颜色基因遗传转化与功能分析

摘要

果皮颜色是黄瓜(Cucumis sativus L.)品种改良的一个重要品质性状，本研究以嫩果皮白色自交系H4为母本，墨绿色自交系Q1为父本，通过杂交获得F1，自交后得到分离群体F2。通过叶绿素含量的测定和叶绿体透射电镜观察，探究引起黄瓜嫩果皮白色的内在生理机理。同时在董绪(2015)对黄瓜白果皮颜色基因研究基础上，进一步用图位克隆法缩小候选基因区域，并通过实时荧光定量PCR分析、TA克隆测序技术筛选控制黄瓜嫩果皮颜色的候选基因，最终转化验证候选基因。主要研究结果如下:
　　1.叶绿素含量测定和叶绿体透射电镜观察
　　黄瓜嫩果皮墨绿色自交系Q1的叶绿素含量比嫩果皮白色自交系H4高，其中以果皮叶绿素含量差异最大。通过叶绿体透射电镜观察两亲本果皮的叶绿体数量和亚显微结构，发现嫩果皮白色自交系H4的叶绿体内部明显空化，出现提前衰老，缺乏淀粉粒，基粒类囊体降解，质体内部结构模糊。与Q1相比，H4的总质体数目减少，叶绿体数量少且体积小。
　　2.标记筛选与基因定位
　　在前人将控制黄瓜白果皮性状的目标基因定位在3号染色体末端的基础上，开发了63对CAPS标记，在Q1、H4和F1中筛选得到5对多态性标记，然后选取1655株嫩果皮白色F2单株进行基因定位，通过两个侧翼标记Q147和Q193将候选区域缩小至100.3kb，包含13个候选基因。
　　3.实时荧光定量PCR分析
　　分析13个候选基因在Q1和H4不同组织中的表达量差异，发现，Csa3G904080在授粉后8d和13d果皮中的表达量差异分别为1.86倍和2.42倍，Csa3G904110在授粉后8d和13d果皮中的表达量差异分别为1.59倍和6.15倍，Csa3G904130在授粉后8d和13d果皮中的表达量差异分别为5.34倍和9.19倍，Csa3G904140在授粉后8d和13d果皮中的表达量差异分别为5.01倍和22.63倍，其余9个基因表达量差异不明显。进一步分析基因Csa3G904080、Csa3G904110、Csa3G904130、Csa3G904140在黄瓜不同组织部位中的表达量差异，基因Csa3G904080在根和茎中的表达量最高;基因Csa3G904110在根、茎和果皮中均有高表达;基因Csa3G904130的表达量在果皮中差异明显，同时在根中也有明显差异;基因Csa3G904140在果皮中的表达量差异明显，在其它组织部位几乎无差异。
　　4.TA克隆测序
　　首先分析表达量有差异的基因在Q1和H4中的编码序列，发现Csa3G904080的编码序列存在3个SNP突变导致3个氨基酸变化;基因Csa3G904110有2个SNP同义突变，无氨基酸改变;基因Csa3G904130的CDS序列在两个亲本中一致，没有发生突变;基因Csa3G904140在第九个外显子末端有一个碱基G插入，导致移码突变提前终止翻译。分析发现，Csa3G904080和Csa3G904140的SNP突变在gDNA中也存在，在17份绿色/白色黄瓜种质资源测序结果表明，Csa3G904080三个外显子的SNP突变与表型不一致，Csa3G904140外显子碱基G插入与表型一致。因此，推测基因Csa3G904140控制黄瓜嫩果皮白色性状。
　　5.Csa3G904140的遗传转化
　　用农杆菌介导法在H4中转入Csa3G904140基因，共获得52株再生植株，有17株PCR检测为阳性。经基因表达量分析，部分转基因阳性植株的表达量有上升。但是表型观察发现，转基因阳性植株的果皮只有稍许变绿，变化不明显。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前沿

1．1 课题的提出

1．2 果皮颜色研究进展

1．2．1 园艺植物果皮颜色研究进展

1．2．2 黄瓜果皮相关基因研究进展

1．3 叶绿素概述

1．3．1 叶绿素的组成和分布

1．3．2 高等植物叶绿素的生物合成、降解及调控

1．4 黄瓜转基因概述

1．4．1 黄瓜组织培养的影响因素

1．4．2 黄瓜遗传转化常用方法

1．5 本课题研究的目的与意义

2 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 供试菌株及载体

2．2 实验方法

2．2．1 叶绿素含量的测定

2．2．2 叶绿体透射电镜

2．2．3 图位克隆

2．2．4 候选区域内基因的表达量分析

2．2．5 候选基因编码序列分析

2．2．6 Csa3G904140基因的超量表达

3 结果与分析

3．1 材料性状观察

3．2 总叶绿素含量分析

3．3 叶绿体显微结构分析

3．4 图位克隆

3．4．1 DNA质量检测

3．4．2 CAPS标记开发

3．4．3 w0基因定位

3．5 实时荧光定量PCR分析

3．5．1 RNA质量检测

3．5．2 候选基因表达量差异分析

3．6 候选基因的测序分析

3．6．1 表达量差异基因的编码序列分析

3．6．2 在17份黄瓜种质资源中检测序列突变是否与表型一致

3．7 Csa3G904140基因的遗传转化

3．7．1 Csa3G904140基因克隆及超量表达载体构建

3．7．2 黄瓜转基因株系的获得

3．7．3 转基因植株PCR鉴定

3．7．阳性苗表型观察及表达量分析

4 讨论

4．1 黄瓜嫩果皮白色基因定位

4．2 确定Csa3G904140为候选基因

4．3 Csa3G904140基因对黄瓜的遗传转化

参考文献

附录

作者简历

致谢