小麦近缘物种低分子量麦谷蛋白亚基的基因克隆、序列分析和原核表达载体的构建

摘要

小麦胚乳中的面筋蛋白赋予面团独特的粘弹性,使其能被加工成各种食品。麦谷蛋白由高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)和低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-GS)组成,它们被认为是使面团具有独特特性的主要决定因素。然而,相对于HMW-GS,由于LMW-GS基因家族的复杂性和普通小麦中LMW-GS等位基因多样性,有关LMW-GS等位基因与面团品质的关系仍不十分清楚。在本研究中,根据小麦属不同物种间LMW-GS基因序列同源性,从茹科夫斯基小麦(Triticumzhukovskyi)和密穗小麦(Triticumcompactum)基因组中,克隆并鉴定了4个新的LMW-GS基因,比较了它们与其他麦类作物中已知的LMW-GS的序列关系,并预测了这四个LMW-GS蛋白二级结构。分析结果表明,它们均属于LMW-i类基因,因此分别命名为TzLMW-i1,TzLMW-i2,TcLMW-i1,TcLMW-i2。与其它LMW-i类亚基相比,这4个新的LMW-i类亚基都有8个保守的半胱氨酸残基(cys)。其中TzLMW-i2在C-末端富半胱氨酸特征区域有一个额外的cys残基,推断其可能参与形成额外的一个链间二硫键,并且在麦谷蛋白网络中充当“链分支者”角色。与其它LMW-i类亚基相比,TcLMW-i2有一个更长的N-末端重复结构域,推断LMW-GS更长的N-末端重复结构域可能有助于与HMW-GS形成链间氢键,且在面筋蛋白中稳定蛋白质—蛋白质相互作用和对其结构与面团性质的影响。最后还构建了这4个新的LMW-GS基因的原核表达载体,初步尝试在大肠杆菌中诱导表达LMW-GS融合蛋白,为进一步纯化重组LMW-GS蛋白,通过掺粉方式研究比较这些LMW-GS蛋白在面筋蛋白网络形成中的作用,以明确其在小麦加工品质改良中的作用奠定基础。

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1 绪 论

1.1 小麦储藏蛋白

1.2 小麦低分子量麦谷蛋白

1.2.1 低分子量麦谷蛋白历史和分类

1.2.2 典型LMW-GS基因的结构和组织

1.2.3 LMW-GS等位基因多样性

1.2.4 典型的LMW-GS结构

1.2.5 LMW-GS在麦谷蛋白多聚物形成中的角色

1.2.6 LMW-GS对质量特性的影响

1.3 LMW-GS与小麦加工品质的关系

1.4 本文研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌株和质粒

2.1.3 软件和网站工具

2.1.4 实验用试剂及试剂盒

2.1.5 常用的试剂及培养基

2.1.6 主要实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 幼苗的培养

2.2.2 材料总DNA的提取

2.2.3 基因组PCR反应

2.2.4 PCR产物的回收

2.2.5 PCR回收产物的连接

2.2.6 转化大肠菌株

2.2.7 阳性克隆的筛选

2.2.8 原核表达载体的构建

3 结果与讨论

3.1 LMW-GS基因PCR克隆与测序

3.3 LMW-GS基因序列比较与分析

3.4 LMW-GS基因编码蛋白质的二级结构预测分析

3.5 LMW-GS基因系统进化分析

4 总结与展望

4.1 总结

4.2 展望

致谢

参考文献

附录一 质粒图谱

附录二 克隆LMW-GS基因测序结果