白血病干细胞及原始细胞表面跨膜TNF-α的单克隆抗体靶向治疗白血病

摘要

背景：很多抗体通过靶向治疗能够显著改善淋巴增殖性疾病的临床预后，但是抗体对包括白血病在内的血液系统其他恶性疾病的临床治疗效果却并不十分理想。改善白血病抗体治疗疗效的关键是明确新型细胞表面抗原，以作为抗体治疗的有效靶点。近来很多研究指出肿瘤坏死因子α（TNF-α）通过创造肿瘤细胞生存生长所需的炎性环境促进肿瘤发生。针对可溶性TNF-α（sTNF-α）的拮抗剂，在I期和II期临床试验中已经显示出了对某些特定实体瘤的临床效果，但是却没有相关数据阐述其对血液系统恶性肿瘤的临床疗效。相对于sTNF-α的研究成果，对跨模型TNF-α（tmTNF-α）与白血病发生的认识却十分缺乏，因此，探索tmTN F-α在急性白血病细胞表面的表达谱及其与急性白血病临床发展的相关性是非常有必要的，这对研制新型抗体，改善白血病疗效和预后具有十分重大的临床意义。
　　方法：利用传统的杂交瘤技术制备能够特异性识别tmTN F-α，而不能识别sTNF-α的单克隆抗体C1。收集临床病例，分析tmTNF-α的表达与急性白血病（AL）临床特性的相关性。将特异性靶向tmTNF-α的单克隆抗体C1或对照IgG加入人AML标本细胞中孵育，以研究抗体的补体依赖的细胞毒（CDC）效应和抗体依赖的细胞介导的细胞毒（ADCC）效应。将人急性髓系白血病（AML）标本细胞异种移植入NOD-SCID小鼠体内，并腹腔规律给予C1或对照IgG，观察C1是否能抑制体内AML细胞的生长；用上述C1或IgG治疗后小鼠的脾脏细胞，经流式分选人CD45+细胞，再次移植入新的NOD-SCID小鼠体内，以评价C1是否对白血病干细胞（LSCs）有杀伤作用，同时将分选的细胞进行mRNA表达谱芯片检测；将稳定转染tmTNF-αshRNA及对照shRNA的人SKM-1细胞系分别移植入NOD-SCID小鼠体内，进一步评价tmTNF-α对白血病发生发展的影响，同时将稳定转染tmTNF-αshRNA及对照shRNA的SKM-1细胞进行mRNA表达谱芯片检测。两组mRN A芯片分析进一步探索了抑制tmTN F-α后对白血病发生发展产生效应的相关机制。数据统计过程中均采用双向P值。
　　结果：TmTNF-α更倾向于表达在白血病细胞表面，且与AL许多预后不良的临床特点密切相关。其中，CD34+高表达，合并髓外浸润或危险分层预后不良组与AML患者tmTNF-α高表达显著相关；而初诊时高白细胞计数，合并髓外浸润或危险分层预后不良组则与急性淋巴细胞白血病（ALL）患者tmTNF-α高表达显著相关。TmTNF-α在白血病细胞表面的表达与其在LSCs表面的表达呈正相关。靶向tmTNF-α的单克隆抗体C1在体外可通过CDC和ADCC效应杀伤白血病细胞，且能够有效抑制小鼠体内人AML细胞的生长，但是对CD34+正常造血干细胞却没有影响。另外，二次移植结果显示C1治疗能够破坏LSCs的再生及重建能力。mRNA表达谱芯片检测数据显示C1杀伤tmTNF-α后，主要通过调节细胞内周期及凋亡及WNT信号通路，抑制AML在NOD-SCID小鼠体内的发生发展。
　　结论：TmTNF-α的表达与AL密切相关，靶向tmTNF-α的单克隆抗体能够在体内外抑制白血病细胞的生长，并破坏LSCs的再生及重建能力，但却对正常造血干细胞没有影响。因此，靶向tmTNF-α的单克隆抗体能选择性清除对常规化疗耐药的白血病克隆，对AL的治疗具有巨大的临床应用潜能。

目录

声明

前言

材料与方法

1．临床标本和细胞系

2．蛋白质印记

3. 酶联免疫吸附试验 (ELISA)

4. 流式分析和细胞分选

5. 免疫组织化学染色分析

6. 补体依赖的细胞毒性实验及中和实验 (CDC)

7. 抗体依赖的细胞介导的细胞毒实验和中和实验 (ADCC)

8. 质粒及电转

9. NOD-SCID小鼠体内试验

10. mRNA表达谱芯片分析

11.实时定量Real-time PCR (q-PCR)

12. Statistical Analysis

结果

1. TmTNF-α高表达于白血病细胞表面，且与急性白血病的不良预后因素相关

2. TmTNF-α表达促进急性白血病细胞生存，并影响其多条信号通路

3. TmTNF-α在HSCs及非造血组织细胞表面的表达谱

4. TmTNF-α抗体通过CDC和ADCC效应体外杀伤白血病细胞

5. 体内给予TmTNF-α抗体单药治疗可选择性抑制NOD-SCID小鼠体内AML细胞的生长

6. TmTNF-α抗体靶向体内LSCs

讨论

参考文献

附表1：流式分析抗体

附表2：引物序列(TsingKe, Wuhan, China)

附表3-1：T mTNF-α 的表达与AML临床特点的关系

附表3-2：T mTNF-α 的表达与ALL临床特点的关系

全文小结

综述:TN F-α与肿瘤发生发展的关系及其治疗前景

1、关于肿瘤坏死因子TNF-α

2、TNF在肿瘤治疗中的应用

3、TNF-α促进肿瘤生长

4、TNF-α促进肿瘤发生发展的机制

5、跨模型TNF-α与肿瘤发生的研究进展

6、TNF-α拮抗剂治疗肿瘤的研究进展

7、展望

参考文献

附录1主要英文缩略词

附录2攻读学位期间发表论文目录

致谢