急性单核细胞白血病THP-1细胞系白血病干细胞的分选、鉴定及靶向治疗的初步研究

摘要

白血病(leukemia)是以骨髓和/或外周血中幼稚细胞增多为特征的血液系统恶性克隆性疾病,白血病干细胞(leukemia stem cell,LSCs)在白血病发生、发展、耐药和复发等方面起重要作用。只有靶向消灭白血病干细胞,才能彻底治愈白血病。因此,识别和清除白血病患者体内的白血病干细胞,对了解白血病成因及治疗具有重要意义。
　　 流式细胞仪细胞技术具有精确度高,速度快等特点,是研究白血病细胞中干细胞分选、LSCs生物学特性的强有力工具。THP-1细胞株是从一个急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)男性患儿的周围血培育出的,为儿童AML的实验和临床前期研究提供了很好的模板。阿糖胞苷(Ara-C)是白血病临床治疗常用药物,主要通过抑制细胞DNA的合成,干扰S增殖期细胞的增殖,而对处于静止期(G0期)的LSCs无效。所以,迫切需要新的治疗策略,以提高白血病的不良预后。
　　 本课题旨在探讨急性单核细胞白血病THP-1细胞系中LSCs比例及生物学特性,并建立人THP-1白血病小鼠模型,探讨THP-1 LSCs与非LSCs致瘤能力的差别,研究CD47在白血病中的表达特点,为LSCs清除寻找靶点。同时探讨抗CD47单克隆抗体单独或联合阿糖胞苷作用时的抗白血病效应,以寻找白血病靶向治疗新策略。
　　 第一部分急性单核细胞白血病细胞系THP-1白血病干细胞的检测、分选及鉴定
　　 目的:
　　 探讨人急性单核细胞白血病THP-1细胞株中是否存在白血病干细胞(LSCs),并观察该LSCs细胞亚群与非LSCs细胞亚群在细胞周期、生长增殖情况、耐药性及耐药蛋白、凋亡基因表达差异,从而进一步鉴定LSCs细胞,了解其生物学活性及特性。
　　 方法:
　　 应用流式细胞术(FCM)测定THP-1细胞株中干细胞在对数生长期THP-1细胞中的比例,然后分选THP-1白血病干细胞,FCM分析该LSCs亚群与非LSCs亚群细胞周期。细胞生长曲线法和集落培养法比较LSCs亚群与非LSCs亚群细胞的增殖能力和集落形成能力。MTT法检测两亚群细胞对阿糖胞苷(Ara-C)敏感性。实时荧光定量PCR检测ABCG2、ABCB1耐药基因和Bcl-2、Bax凋亡基因在两亚群细胞中表达差异。
　　 结果:
　　 1.在白血病THP-1细胞株中存在免疫表型为CD34+CD38-的LSCs,比例为0.12±0.06％;收集分选后LSCs管细胞再次上流式细胞仪进行LSCs细胞纯度检测示:细胞集中于之前的LSCs区域,比例高达97.0±1.7%。
　　 2.收集分选后的THP-1LSCs和非LSCs,流式细胞仪检测两群细胞各样本的细胞周期,可见在分选后的LSCs亚群中大部分的细胞处于静止期,G0/G1期比例达94.03±1.61%,明显高于非LSCs比例,差异有统计学意义;非LSCs亚群增殖期细胞比例相对较高,分别为S/G2/M期细胞比例为56.58±1.59%。3.LSCs和非LSCs细胞的生长曲线不同。在接种后的第1和2天,二者无明显差异,从第3天起LSCs细胞大量增加,快速增殖至指数生长期;非LSCs细胞生长、增殖缓慢,在第5天进到平台期。LSCs和非LSCs生长速度差异显著(P＜0.05)。分选后的THP-1细胞及未分选的THP-1细胞进行集落培养96小时后显微镜下观察发现LSCs细胞集落形成率明显大于非LSCs组(P＜0.05),且每个集落细胞数量高于非LSCs组。
　　 4.在12-48小时各时间点,阿糖胞苷作用于THP-1LSCs细胞的IC50均高于非LSCs细胞,24小时对THP-1LSCs细胞的及非LSCs的IC50分别为216uM和149uM,48小时对THP-1LSCs的IC50值为198 uM,非LSCs的IC50值为138 uM(P=0.042)。
　　 5.实时荧光定量PCR结果显示:LSCs和非LSCs细胞亚群表达ABCG2的水平分别是9.01±1.12和0.65±0.04(P＜0.05),表达ABCB1的水平同样高于非LSCs亚群(P＜0.05);LSCs亚群中,Bcl-2表达值为0.99±0.08,非LSCs亚群表达值为0.29±0.13,二者差异有统计学意义(P＜0.05);LSCs亚群中,Bax表达值为0.68±0.05,非LSCs亚群Bax表达值为0.85±0.09,统计学比较后,差异没有统计学意义(P＞0.05),但是Bcl-2/Bax比值显著高于非LSCs细胞亚群(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 在人急性单核细胞白血病THP-1细胞株中确实存在LSCs细胞,这群LSCs细胞比例少,其和主群细胞相比在集落形成能力、生长增殖能力和耐药蛋白、凋亡基因表达上有异质性,大部分处于静止期,可能与肿瘤的耐药和复发有关。
　　 第二部分 NOD/SCID小鼠THP-1细胞系急性单核细胞白血病模型的建立
　　 目的:
　　 研究CD47在不同细胞亚群中的表达,为寻找儿童急性髓细胞白血病治疗的靶点提供实验基础;通过将分选的人急性单核细胞白血病THP-1干细胞移植到NOD/SCID小鼠,探讨其致瘤能力。
　　 方法:
　　 应用流式分选技术分选THP-1LSCs,并用阿糖胞苷富集THP-1中的LSCs,流式细胞仪检测CD47在不同亚群THP-1细胞中的表达,计算检测到的CD47+比例。NOD/SCID小鼠分别经尾静脉接种不同亚群及剂量的THP-1细胞,比较不同实验组小鼠的生存时间、组织病理改变及通过流式细胞术检测CD33、CD45在模型鼠外周血、骨髓及肝、肺组织中的表达,比较不同细胞数量和种类接种小鼠的成瘤率及生存率。
　　 结果:
　　 1.CD47在THP-1细胞不同亚群中的表达有差异,在未分选的THP-1细胞的表达最低,随着与阿糖胞苷作用时间增长,LSCs比例增高,CD47表达升高,在分选的THP-1LSCs中表达最高,差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 2.1×103数量的THP-1LSCs可在4周后形成典型的NOD/SCID小鼠白血病浸润模型,未分选的THP-1细胞至少需要1×106才能成瘤,1×103数量的THP-1LSCs与抗CD47单克隆抗体共移植组仅有1只检测到白血病细胞,成瘤率低于THP-1LSCs移植组。各组间白血病发病率差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 3.THP-1干细胞NOD/SCID小鼠腹腔可见实体肿瘤块,取瘤块做病理,可见大量白血病细胞。接种后3周外周血可见白血病细胞,骨髓形态学检测见大量原始和幼稚细胞,流式细胞仪检测有CD33、CD45表达。
　　 结论:
　　 1.静脉或腹腔接种小剂量THP-1LSCs细胞于NOD/SCID小鼠能建成全身播散的白血病模型,该模型较好地反映白血病干细胞在体内有较强的致瘤能力,是进行新药疗效试验、生物导向治疗及基因治疗的理想工具。
　　 2.CD47在分选的THP-1LSCs中表达较高,可作为清除白血病干细胞的重要靶点。
　　 第三部分抗人CD47单克隆抗体靶向治疗NOD/SCID小鼠急性单核细胞白血病的实验研究
　　 目的:
　　 通过研究CD47在人急性单核细胞白血病THP-1细胞移植白血病小鼠中的表达,探讨CD47在急性髓细胞白血病的预后意义;研究小鼠抗人CD47单克隆抗体在体内和体外对人THP-1 LSCs的清除作用,探讨急性髓细胞白血病靶向治疗的最佳策略。
　　 方法:
　　 流式细胞仪检测CD47在正常和THP-1 NOD/SCID白血病小鼠中的表达,观察CD47对NOD/SCID白血病小鼠预后的影响。将分选的THP-1 LSCs细胞与人外周血巨噬细胞或小鼠巨噬细胞在终浓度为7μg/ml鼠抗人CD47单克隆抗体和鼠抗人CD45单克隆抗体的培养液中共培养2h,倒置荧光显微镜观察巨噬细胞的吞噬指数。应用单独阿糖胞苷、单独鼠抗人CD47单克隆抗体或阿糖胞苷联合鼠抗人CD47单克隆抗体治疗NOD/SCID白血病小鼠,流式细胞仪检测白血病小鼠外周血及骨髓CD33、CD45细胞,进行疗效分析。
　　 结果:
　　 1.CD47在正常NOD/SCID小鼠外周血单个核细胞表达值为14.1±2.14%,在骨髓单个核细胞中表达值为30.7±3.09%,在BULK THP-1中表达值为56.3±3.49%,在THP-1 LSCs表达值为73.8±5.34%,几组间差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 2.CD47high组小鼠肝、肺、脾、腹水、睾丸、椎旁肌肉、淋巴结和面颊肌肉等脏器及组织均能发现白血病细胞的浸润,CD47low组则浸润不明显。CD47high组总生存时间明显长于CD47low组,二者差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 3.在体外实验中,小鼠抗人CD47单克隆抗体可明显增加巨噬细胞对LSCs的吞噬能力,吞噬指数明显高于鼠抗人CD45单克隆抗体组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 4.在白血病小鼠体内,阿糖胞苷联合抗CD47单克隆抗体可有效靶向杀灭白血病细胞,而骨髓抑制与单独用阿糖胞苷无区别。K-M生存分析发现,阿糖胞苷联合抗CD47单克隆抗体生存时间明显长于其它各组。
　　 结论:
　　 1.CD47高表达是急性髓细胞白血病一项独立的不良预后因素。
　　 2.阿糖胞苷联合抗CD47单克隆抗体可有效靶向杀灭白血病细胞,对清除白血病干细胞、彻底治愈急性髓细胞白血病具有重要的方法学意义。