急性单核细胞白血病细胞系THP-1侧群细胞的分选、鉴定与富集

摘要

目的:
　　 肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)理论从一个崭新的角度阐述了肿瘤的发病机制,该理论指出在肿瘤组织中存在极少一部分在通常情况下处于静止期的肿瘤细胞,这些细胞除具有极其强的自我更新、增殖和分化能力外,还具有体内外高度致瘤能力,是驱动肿瘤形成和发展的最主要力量。CSCs因其自身特点能够抵御传统抗肿瘤药物的杀伤,成为肿瘤耐药和复发的根源。因此,只有靶向清除CSCs,才有可能彻底治愈肿瘤。白血病是儿童最常见的恶性肿瘤,CSCs首先在白血病的研究中得到了证实,白血病患者体内存在的CSCs也被称为白血病干细胞(Leukemia stem cells,LSCs)。
　　 CSCs已经成为医学领域的研究热点,希望通过研究CSCs,为肿瘤的靶向治疗提供新思路,如何寻找、分离、获得高纯度的CSCs就显得尤为重要。侧群(Sidepopulations,SP)细胞具有干细胞的生物学特性,从肿瘤细胞中分离出的SP细胞富含CSCs。利用SP细胞能够高效率将荧光染料Hoechst33342泵出细胞外的特性,再结合流式细胞仪荧光激活细胞分选法是目前公认的分离CSCs的方法。
　　 白血病细胞系也具有体外无限传代的特性,本研究旨在检测人急性单核细胞白血病细胞系THP-1中是否存在SP细胞,对该SP细胞分选后探讨其是否具有LSCs活性及生物学特点,并探讨利用细胞周期特异性药物阿糖胞苷(Ara-C)从人白血病细胞系THP-1中富集SP细胞的方法,为进一步认识LSCs奠定基础。研究方法:
　　 1.将对数生长期的THP-1细胞用Hoeehst33342染色,荧光显微镜观察THP-1细胞株中是否存在拒染或淡染的SP细胞,观察SP细胞的形态,计算SP细胞所占比例。并将Hoeehst33342染色后的THP-1细胞再应用流式细胞术检测,观察是否存在SP细胞及其所占的比例。
　　 2.流式细胞仪分选出THP-1细胞中SP细胞和非SP(NSP)细胞,并分析SP细胞和NSP细胞表面抗原(CD34、CD38)的表达及细胞周期;细胞生长曲线法和集落培养法比较SP细胞和NSP细胞的增殖能力和集落形成能力:半定量PCR和实时荧光定量PCR检测ABCG2、ABCB1耐药基因和Bcl-2、Bax凋亡基因在两亚群细胞中表达差异。
　　 3.将对数生长期THP-1细胞用10μg/ml、100μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml分别相当体内用小剂量、常规剂量、中剂量和大剂量Ara-C的药物浓度处理24h,离心洗涤,Hoechst33342染色后,用流式细胞仪检测SP细胞比例的变化,从而对SP细胞进行富集。
　　 结果:
　　 1.将THP-1细胞用Hoechst33342染色后涂片,用倒置荧光显微镜在紫外光下观察,可见绝大部分细胞因被Hoechst33.342染色呈现强蓝色荧光(NSP细胞),而仅有极少一部分的细胞呈现微弱蓝色荧光或不发光的细胞,这部分细胞就是SP细胞,在全部细胞中占(4.85±1.35)％,SP细胞及NSP细胞在形态学上无明显差异。加入维拉帕米拮抗后,未见到拒染或淡染的SP细胞。随后,将染色后细胞上流式细胞仪进一步检测,在THP-1细胞中检测到比例为(1.81±0.99)%的SP细胞,这群细胞位于两种荧光强度均弱的左下角区域,加入维拉帕米拮抗后,SP细胞比例明显下降至接近0%水平或完全为0%。
　　 2.流式细胞仪分选SP细胞和NSP细胞,分选的纯度达到(96.71±0.90)%;细胞周期检测可见大部分的SP细胞处于静止期,G0/G1期细胞比例达到(84.04±4.98)%,明显高于NSP细胞比例,NSP细胞增殖期比例相对较高,S/G2/M期细胞比例为(56.38±1.48)%;在未分选THP-1细胞、SP细胞和NSP细胞亚群各样本中,CD34、CD38都处于低表达的状态,CD34+、CD34+CD38-细胞在SP细胞中比例要高于NSP细胞的(P<0.05);从生长曲线看,从第3天起SP细胞组细胞大量增加,快速增殖至指数生长期;NSP细胞生长缓慢,在第5天进到平台期;集落培养观察发现SP细胞集落数量明显大于NSP细胞,且每个集落细胞数量也高于NSP细胞;实时荧光定量PCR结果显示:SP细胞及NSP细胞亚群表达ABCG2的水平分别是7.61±1.15和0.25±0.03(P<0.05),SP细胞表达ABCB1的水平同样高于NSP细胞(P<0.05)。Bcl-2在SP细胞中的表达值为0.99±0.08,在NSP细胞表达值为0.29±0.13,二者差异有统计学意义(P<0.05);SP中Bax表达值(0.68±0.05)与NSP细胞表达值(0.85±0.09)相比,差异没有统计学意义(P>0.05),但是Bcl-2/Bax比值显著高于NSP细胞(P<0.05)。
　　 3.经与Ara-C共培养24 h后,SP细胞的比例显著提高,而且随着Ara-C浓度增大,SP细胞比例也越高。
　　 结论:
　　 1.在人急性单核细胞白血病细胞系THP-1中确存在少量的SP细胞,这群细胞和NSP细胞相比更具有干细胞的生物学特点,可能富含LSCs。
　　 2.与一定浓度阿糖胞苷共培养可以富集THP-1细胞系中的SP细胞,可作为LSCs研究的切入点,对进一步研究白血病有重要意义。