前体蛋白酶对非小细胞肺癌cGMP依赖性蛋白激酶选择性剪切作用的研究

摘要

第一部分前体蛋白酶与PKG-1在肺癌组织中的表达以及临床意义研究
　　目的：探讨PC家族蛋白和PKG-1蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达及其与临床病理特征之间的关系。
　　方法：免疫组织化学法检测178例非小细胞肺癌患者，肿瘤组织标本以及癌旁组织标本中PC家族蛋白以及PKG-1蛋白表达水平；医学统计学分析，各因子表达水平与患者性别、年龄、病理类型、淋巴结转移、临床分期、远处转移等临床参数的相互关系。
　　结果：
　　1. PC-5、furin、PC-7和PKG-1在非小细胞肺癌组织中及癌旁组织中的表达:
　　PC-7、furin在非小细胞肺癌组织中阳性表达率分别为:44.4％以及51.7%，均显著高于非小细胞肺癌癌旁组织（P<0.05)；PC-5在非小细胞肺癌中的表达(19.1%)低于癌旁组织(20.6%)(P>0.05)；PKG-1在非小细胞肺癌及癌旁组织中阳性表达率分别为6.2%和57.8%（P<0.05）。
　　2. PC-5、furin、PC-7和PKG-1与非小细胞肺癌临床病理参数的关系：
　　PC-7、furin表达均与非小细胞肺癌分期、组织分化及淋巴结转移正相关（P<0.05），与性别、年龄无关（P>0.05）；PC-5在鳞癌表达率（22.2%）显著低于腺癌表达率（75.6%）；与淋巴结转移、临床分期负相关（P<0.05），与性别、年龄无关（P>0.05）。PKG-1与各非小细胞肺癌临床病理参数均无关（P>0.05）。
　　结论：PC-7、furin可能在非小细胞肺癌的发生与发展中起促进作用，PKG-1与非小细胞肺癌的发展无关。
　　第二部分非小细胞肺癌前体蛋白酶对PKG-1蛋白剪切的研究
　　目的：通过前体蛋白酶的过表达以及抑制其活性，检测 cGMP依赖性蛋白激酶的剪切水平，探讨 cGMP依赖性蛋白激酶选择性剪切的分子机制。
　　方法：构建 cGMP依赖性蛋白激酶表达质粒 pCDNA3-PKG-1，通过hexa-D-arginine、dec-RVKR-cmk以及α1-PDX抑制前体蛋白酶活性；过表达前体蛋白酶表达的质粒；免疫印迹法检测在抑制以及过表达前体蛋白酶的条件下，cGMP依赖性蛋白激酶蛋白分子的剪切水平变化；构建不同位点，点突变的 cGMP依赖性蛋白激酶分子异构体，检测前体蛋白酶对cGMP依赖性蛋白激酶剪切的蛋白靶点。通过免疫荧光法检测抑制前体蛋白酶活性后，对cGMP依赖性蛋白激酶核转位的抑制作用。
　　结果：Western-bloting显示细胞内过表达前体蛋白酶家族成员 furin，PC7能够促进细胞内 cGMP依赖性蛋白激酶蛋白分子剪切，而通过 dec-RVKR-cmk以及α1-PDX能够抑制细胞内c G M P依赖性蛋白激酶剪切；通过不同的PKG异构体作用。可以发现前体蛋白酶对c G M P依赖性蛋白激酶的剪切位点在161位氨基酸处。抑制前体蛋白酶活性能够抑制 cGMP依赖性蛋白激酶从胞浆中转位进入细胞核内。
　　结论：前体蛋白酶能够剪切c G M P依赖性蛋白激酶分子，其剪切位点为161位氨基酸分子，前体蛋白酶对cGMP依赖性蛋白激酶分子的剪切作用是其进行核转位的必要过程。

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前言

第一部分 前体蛋白酶与PKG-1在肺癌组织中的表达以及临床意义研究

引言

材料与方法

实验结果

讨论

第二部分 非小细胞肺癌前体蛋白酶对PKG-1蛋白剪切的研究

引言

材料与方法

实验结果

讨论

参考文献

综述

附录：攻读博士学位期间发表论文

致谢