甲基苯丙胺急性中毒大鼠心肌表达差异性蛋白初筛

摘要

背景：
　　甲基苯丙胺（methamphetamine，MA，MAP，MAM）是近年来在公共场所流行滥用的成瘾性药物，俗称“冰毒”（ice）。与传统的海洛因、可卡因等相比，MA作为新兴毒品已经在全世界，尤其是东亚地区广泛滥用。在我国，MA的主要使用者为年轻人。近年来，随着经济的飞速发展，MA的流行趋势已从前几年的东南沿海地区迅速向内地蔓延。由于MA可导致严重中毒症状，从而引起严重的社会问题。近年来，MA所导致的死亡也逐年增加。
　　目前，国内外的研究已经证实了MA有神经毒性外，还具有肺毒性、肝毒性和心肌毒性等。国内外大量的案例报道及实验研究已证实了MA会导致严重的心肌损害，对其机制的研究近年来也呈现明显的上升趋势。目前的研究表明，MA急性中毒可导致心血管功能的异常，临床上主要变现为心率的加快，血压的升高，心肌耗氧量增加，心律失常，心肌缺血，甚至心功能衰竭。已知的研究数据表明，MA可通过神经毒性增加血液中肾上腺素、去甲肾上腺素途径从而引起间接心肌毒性。虽然大量的证据证实了MA可以导致心血管功能及心脏结构的异常，但其作用机制目前尚未完全明了。目前多数研究都在证实MA会引起心肌蛋白的异常表达，研究方向也主要是验证性研究，以探索MA急性中毒对心脏结构和功能的影响，尚未能建立起完整的研究方向。
　　目的：
　　本研究通过建立MA急性中毒大鼠模型，对其心肌蛋白进行全面的筛查，系统筛选出与MA急性心肌毒性作用相关的差异性蛋白，建立起MA急性中毒大鼠心肌蛋白质差异性表达的研究基础，同时对选取有意义的蛋白质进行深入研究，探讨MA对大鼠心肌的急性毒性机制。同时为后续的MA急性中毒研究提供研究基础。
　　1.建立MA急性中毒大鼠模型，观察MA急性中毒对大鼠活动的影响；
　　2.观察MA急性中毒对大鼠心肌结构的影响；
　　3.筛选与MA心肌毒性作用相关的差异性蛋白；
　　4.根据差异性蛋白质的筛查结果，探讨MA心肌毒性机制。
　　方法：
　　1.建立大鼠MA急性中毒模型：将20只雄性的SD大鼠随机分为MA急性中毒组和对照组。MA急性中毒组给予MA（10mg/kg，i.v.，间隔两个小时，给药4次）建立急性MA中毒大鼠模型，根据大鼠的行为改变评价中毒模型是否成功建立；对照组给予生理盐水（10mL/kg,i.v.，间隔两个小时，给药4次），两组大鼠在最后一次给予MA/生理盐水后24h水合氯醛麻醉后处死。对MA急性中毒组和对照组大鼠心脏进行称重，计算出各组心脏系数（心脏/体重），检测MA急性中毒对心脏重量的影响。取MA急性中毒组和对照组大鼠心脏心尖部心肌用多聚甲醛固定，进行组织病理学检查，HE染色，观察MA急性中毒组心肌病理组织学结构的改变；取两组大鼠心脏左心室壁心肌行电子显微镜检查，观察MA急性中毒对大鼠心肌超微结构的影响。
　　2.取两组大鼠心室肌100mg，提取心肌蛋白进行双向凝胶电泳和质谱鉴定，筛查MA急性中毒心肌差异性蛋白。
　　3.通过免疫印迹技术（Western-Blotting）和实时定量PCR技术（Real-time qPCR），对差异性蛋白质进行回复验证。
　　结果：
　　1.组织病理学
　　与对照组相比，MA急性中毒组大鼠心肌细胞出现明显的空泡样变性，心肌间质点灶性炎细胞浸润，心肌间质轻度纤维结缔组织增生，灶性心肌细胞肥大，部分心肌细胞间分界不清。
　　2.电子显微镜检查：
　　MA急性中毒组心肌线粒体变形，线粒体肿胀，线粒体嵴发生明显的断裂、溶解。
　　3.与对照组相比，MA急性中毒组大鼠心脏系数明显增高（P＜0.01），心脏重量增加。
　　4.差异性蛋白筛查
　　对MA急性中毒大鼠心肌差异性蛋白行双向电泳进行筛查，共筛查出心肌差异性表达蛋白100个，质谱鉴定13个差异性蛋白。其中MA急性中毒组大鼠心肌蛋白表达提高的7个，降低的6个。
　　5.MA急性中毒大鼠心肌差异性蛋白的回复验证（Western-blot、Rt-PCR）
　　MA急性中毒大鼠心肌乙醛脱氢酶（ALDH2）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶-1a（NDUAA）表达明显降低，而热休克蛋白-b1（HSP-b1）表达明显升高。
　　结论：
　　1.MA急性中毒会导致心脏结构的改变，主要表现为心肌细胞内空泡形成，心肌间质炎细胞浸润。
　　2.MA急性中毒会导致心肌细胞内细胞器的损伤，主要表现为线粒体的肿胀，线粒体嵴的溶解消失。
　　3.MA急性中毒会导致心肌内蛋白的差异性表达，鉴定蛋白质13个，其中，呼吸作用相关蛋白7个，对心肌有保护性蛋白3个且表达均呈现升高趋势。
　　4.MA急性中毒诱导了心肌细胞内ALDH2表达降低，从而导致心肌内乙醛的堆积，氧自由基增多，是MA急性中毒导致心肌损伤的直接原因之一。氧自由基的增加是心肌内线粒体发生损伤重要因素之一。同时，ALDH2表达降低也减少了还原型NADH的生成，对呼吸作用的正常进行形成阻碍。
　　5.MA急性中毒导致了大鼠心肌细胞内呼吸链的断裂，NDUAA表达降低使正常细胞呼吸作用受阻，引起呼吸功能异常，在MA导致心肌耗氧量增加的情况下，呼吸功能的异常导致了细胞功能不足，同时，正常的呼吸作用可以清除心肌内氧自由基，心肌供氧不足导致了心肌细胞损伤。
　　6.MA急性中毒导致的呼吸链断裂、氧化应激反应反射性引起了保护性蛋白Hsp27表达升高。