高血压性心脏病左心室心肌表达差异性蛋白初筛

摘要

高血压（Hypertension）是一种以体循环动脉血压升高为主要表现，并能引起心脏、血管、脑和肾脏等器官功能性或器质性改变的全身性综合性疾病，国际范围内的患病率约为25％~30%，是成人患病和死亡的主要原因之一。高血压性心脏病是高血压并发症中最常见的临床表现，其分子机制至今没有完全阐明。早期基因组学的研究成果，由于存在着转录、翻译及翻译后水平调节，最终并不一定在蛋白质水平上表现出来。而利用免疫组织化学等方法，仅能对有限个数的蛋白质进行有效分析，无法满足当前高通量研究的需求。
　　差异蛋白质组学是目前蛋白质组学研究中应用最为广泛的研究方法，该方法通过对比分析机体不同状态或近似物种间机体表达蛋白质的差异性，从而实现对机体内代谢调控的监测，探索机体对内外界环境变化产生反应的基本规律。差异蛋白质组学研究能够反应机体蛋白质的动态本质，且采用成熟的双向电泳、质谱技术等，具有广泛的应用前景。但目前的研究大多以动物种系为主，以人体心脏标本进行高血压性心脏病蛋白质组学的研究还少有报道。
　　在法医病理学检案过程中，涉及大量尸体标本，而人体死亡后，尸体通常条件下被放置于-20℃以下环境中保存。这类尸体保存良好，蛋白质等生物大分子降解程度低，能够为生命科学研究提供大量的实验材料。且法医病理学检案中高血压性心脏病的较高出现率，提供了可靠的检材来源，为利用人体心肌标本进行高血压性心脏病研究提供了前提条件。
　　目的:
　　本研究利用法医病理学实践中获得的人体心脏左心室心肌标本，利用蛋白质组学的方法，对心肌组织蛋白进行全面筛查，寻找与高血压和高血压性心脏病相关的差异性蛋白，建立以人体心脏标本进行心肌蛋白质差异性表达的研究基础，同时选取部分蛋白质进行深入研究，探讨其在高血压和高血压性心脏病形成过程中的作用，更深入的研究高血压和高血压性心脏病提供新的线索。
　　1.建立人体左心室心肌组织表达蛋白质图谱；
　　2.分析无高血压、高血压和高血压性心脏病状态下心肌表达差异性蛋白质；
　　3.选取部分蛋白质进行质谱鉴定，并对鉴定出的蛋白质进行深入研究，寻找其参与高血压和高血压性心脏病形成中的机制。
　　方法:
　　1.收集保存良好尸体心脏左心室心肌标本，并根据法医病理学检查结果结合研究目的进行分组（无高血压病（NHT）、单纯高血压病（HT）及高血压性心脏病（HHD））；
　　2.三组左心室心肌各100mg，分别提取心肌蛋白进行双向凝胶电泳和质谱鉴定，对比分析NHT、HT和HHD心肌差异性蛋白；
　　3.通过免疫印迹技术（Western-Blotting）和实时定量PCR技术（Real-time PCR），对差异性蛋白质进行回复验证。
　　结果:
　　1.通过对三组凝胶图像进行两两组间对比分析，在 HT3-HHD2对比组蛋白表达升高67个，降低39个；NHT1-HHD2对比组蛋白表达升高50个，降低32个；NHT1-NT3对比组蛋白表达升高98个，降低103个；
　　2.通过质谱鉴定，共鉴定出8组蛋白质，包括休克蛋白B1（HspB1）、过氧化物氧化还原酶（Prx2）、ATP合成酶（ATP5A1）、纤维蛋白原(FIBB)、抗胰蛋白酶(A1AT)、维生素D链接蛋白(VTDB)、丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin B6)、电压依赖性阴离子通道蛋白(VDAC1)；
　　3.选取HspB1、Prx2和ATP5A1三心肌差异性蛋白的回复验证（Western-blot、RT-PCR），结果与双向电泳结果一致；
　　4.热休克蛋白B1（HspB1）在HT组中的表达量明显高于NHT组，在HHD组中的表达量明显低于HT组，而HHD组和NHT组中表达量没有明显差异；过氧化物氧化还原酶（Prx2）在HT组中的表达量明显高于NHT组，而在HHD组中的表达量明显低于NHT和HT组；ATP合成酶α亚基（ATP5A1）在HT和HHD组中的表达量则均明显低于NHT组，而在HT和HHD组中的表达量没有明显差别。
　　结论:
　　1.通过对NHT、HT和HHD左心室心肌组织蛋白进行分离，获得了无高血压病（NHT）、单纯高血压病（HT）及高血压性心脏病（HHD）状态下人体左心室心肌组织蛋白质的双向电泳图谱；
　　2.相比NHT组，HT组有98个蛋白质表达升高，103个表达降低；相比NHT组，HHD组有50个蛋白质表达升高，32个表达降低；相比HT组，HHD组有67个蛋白质点表达升高，39个降低；并通过质谱对其中8组蛋白质点进行了鉴定；
　　3.NHT、HT和HHD三组表达改变的蛋白质涉及氧化应激，能量代谢等过程；
　　4.本研究发现的蛋白质点为高血压和HHD的研究提供了新的方向和线索。

目录

封面

声明

目录

主要缩略语英文对照

中文摘要

英文摘要

前言

技术路线图

实验材料

1实验对象

2主要试剂及试剂盒

3主要试剂的配制及保存

4主要试验器材及设备

5所用软件及检索的数据库

实验步骤

1检材的提取、保存与分组

2心肌蛋白质的提取、纯化及蛋白浓度的测定

3双向凝胶电泳（Two-dimensional gel-electrophoresis，2-DE）

4凝胶图像采集

5图像分析

6考马斯亮蓝染色凝胶的制作

7差异性表达蛋白质点的挖取及胶内胰酶消化

8质谱鉴定

9数据库检索

10 Western Blot

11 Real-time PCR

实验结果

1双向电泳结果

2 NHT、HT、HHD心肌组间差异性蛋白筛查结果

3选择蛋白质点进行质谱鉴定

4质谱鉴定出的有表达差异的蛋白质

5差异蛋白质的质谱图谱及检索结果分析

6选取差异性蛋白结果进行回复验证

讨论

1氧化应激诱导心肌肥厚

2热休克蛋白B1（HspB1）

3过氧化物还原酶2（Prx2）

4 ATP合成酶亚基α亚基（ATP5A1）

5其他蛋白质

结论

中文综述: 蛋白质组学技术及其在高血压相关疾病研究中的进展

硕士期间发表论文

致谢