BRAFV600E突变联合临床及病理特征在PTC诊断、预后判断及131I疗效预测中的研究

摘要

近年来，甲状腺恶性肿瘤的发病率在全球呈“爆发式”增长，其中以甲状腺乳头状癌（Papillary Thyroid Carcinoma，PTC）的发病率上升最为明显。在给予包括手术、术后促甲状腺激素（Thyroid Stimulating Hormone，TSH）抑制治疗及131I内照射治疗的个体化综合治疗后，甲状腺乳头状癌有着较好的预后，死亡率较低。但临床中不乏局部转移较早、复发风险高、131I治疗效果差的高风险患者。如何尽早识别这部分患者，明确甲状腺乳头状癌的高危特征，对制定个体化的治疗方案、建立正确的随访模式、提高乳头状癌患者的整体预后具有深远意义。
　　BRAFV600E突变是甲状腺乳头状癌中最有意义的基因事件之一。BRAF蛋白是MAPK通路（RAS-RAF-MAK-ERK细胞信号途径）上的一员，该基因突变导致BRAF蛋白持续激活，直接引起下游MEK蛋白的磷酸化，最终导致上述信号途径持续激活，引起细胞过度增殖、分化及肿瘤的发生。较多研究结果提示：1.甲状腺乳头状癌中有着较高的 BRAFV600E突变率，约32％~73%。在甲状腺良性肿瘤及其他病理类型的甲状腺恶性肿瘤中并未发现该基因的突变，有着较高的诊断价值；2.伴有BRAFV600E突变的乳头状癌，侵袭性强、复发风险高、131I治疗效果差、死亡率高。但近年来出现了许多相反的结论，认为该突变与乳头状癌的侵袭性特征并无相关性，并且一些传统复发风险评估为“低风险”的乳头状癌同样检测到 BRAFV600E突变。BRAFV600E突变是否是影响甲状腺乳头状癌生物学行为的独立因素，结论尚不统一。
　　研读此类结果时我们发现，绝大部分的研究重点在分析BRAFV600E突变与各种预后的影响因子之间的关系，而BRAFV600E突变率本身是否受临床特征及组织病理特点的影响尚无广泛研究。BRAFV600E突变对预后的判断、131I治疗效果的预测，是否会因临床、病理特征的不同而有差异，结论也不得而知。
　　基于上述思路，我们在国内较早开始综合性分析BRAFV600E突变在临床实际应用中的影响因素和价值。我们的研究首先探讨影响甲状腺乳头状癌BRAFV600E突变率的临床特征，包括年龄、性别、术前甲状腺血清学检验结果，寻找影响BRAFV600E突变诊断意义的临床特征；其次探讨BRAFV600E突变在甲状腺乳头状癌预后判断中的提示意义，分析该突变与颈淋巴结转移、甲状腺外侵犯、MACIS评分、病理亚型及TNM分期的相关性，并研究临床、组织病理特征对该相关性的影响；最后研究BRAFV600E突变对钠碘同向转运体（the Na+/I- Symporter，NIS）蛋白表达的影响，分析影响NIS蛋白表达的因素，间接讨论该突变对131I治疗效果的影响。通过以上研究，我们不仅探讨BRAFV600E突变的独立临床意义，而且也进一步结合临床病理特征分析该突变，为甲状腺乳头状癌临床决策制定中的联合应用提供新的思路和依据。
　　第一部分BRAFV600E突变联合临床特征对PTC诊断的提示意义
　　目的：对比研究BRAFV600E突变在甲状腺乳头状癌和良性肿瘤中的差异，探讨该基因突变与术前临床特征的相互关系和相互影响。
　　方法：回顾性分析华中科技大学附属同济医院甲乳外科2013年6月至2014年6月间同一手术组收治的甲状腺乳头状癌及结节性甲状腺肿病例，按照纳入及排除标准筛选病例。切取石蜡组织提取基因组DNA，RT-qPCR方法检测BRAFV600E突变。统计学分析BRAFV600E基因突变与临床特征（年龄、性别、血清甲状腺相关检验结果）的相关性。
　　结果：共纳入PTC134例，结节性甲状腺肿（NodularGoiter，NG）37例。1.PTC组BRAFV600E突变率为68.7%，NG组为0%；2. PTC组，BRAFV600E突变与年龄、术前血清甲状腺球蛋白抗体水平（Tg-Ab）存在明显相关性，与性别、TSH水平、游离甲状腺素水平（FT4）、游离甲状腺三碘原氨酸水平（FT3）、甲状腺球蛋白水平（Tg）、甲状腺过氧化物酶抗体水平（TPO-Ab）、促甲状腺激素受体抗体水平（TSHR-Ab）无明显相关性。3.统计学分析示，年龄＞38岁亚组的突变率明显高于≤38岁亚组（OR=2.63,95%Cl=1.17,5.92 p=0.020）；结合临床，术前血清Tg-Ab和TPO-Ab水平异常升高亚组的突变率明显低于两抗体正常亚组（OR=0.357,95%Cl=0.129,0.985，p=0.047;OR=0.333,95%Cl=0.129,0.86，p=0.023）。
　　结论：甲状腺良性肿瘤中几乎没有BRAFV600E突变，当检测到突变时，诊断为甲状腺乳头状癌的可能性较大；对疑似恶性行BRAFV600E突变检测，但未检测到突变的甲状腺结节患者，如伴有突变率可能偏低的临床特征（如年龄低于38岁、血清Tg-Ab和（或）TPO-Ab异常升高），应建议进一步手术或更加密切的随访。
　　第二部分BRAFV600E突变联合临床病理特点对PTC预后的提示意义
　　目的：研究BRAFV600E突变与PTC预后特征的相关性，探讨临床、组织病理特点对该相关性的影响。
　　方法：回顾性分析第一部分所纳入的乳头状癌病例。分析与颈淋巴结转移、甲状腺外侵犯相关的临床病理特征，分析BRAFV600E突变对颈淋巴结转移、甲状腺外侵犯的独立作用；取石蜡切片行HE染色重读病理亚型，根据手术记录、病理报告计算TNM分期和MACIS评分，分析BRAFV600E突变与MACIS评分的相关性；分析病理亚型、TNM分期各亚组BRAFV600E突变率的差异。
　　结果：1.年龄（OR=0.908，p＜0.001）、肿瘤最大径（OR=1.07，p=0.01）是影响颈淋巴结转移的独立因素；年龄不同时，BRAFV600E突变对颈淋巴结转移的作用不同，多因素调整年龄、肿瘤最大径、合并桥本甲状腺炎（Hashimoto’s Thyroiditis，HT）、血清学相关检验水平等，显示BRAFV600E突变对颈部淋巴结转移是促进因素，但无统计学差异（OR=1.16，p=0.775）。2.肿瘤总直径是影响甲状腺外侵犯的因素，差异接近显著（OR=1.04，p=0.064）；突变组的甲状腺外侵犯比例高，多因素调整年龄、合并HT、血清学相关检验水平、肿瘤总直径后，差异仍显著（OR=7.452，p=0.009）；3.突变组MACIS评分平均值高，多因素分析调整合并HT、血清学相关检验水平，差异显著（β=0.42,p=0.027）；4.经典型PTC111例，BRAFV600E突变率72.0%，高细胞型PTC13例，突变率92.3%，滤泡亚型PTC10例，没有突变；5.突变组的IVa期肿瘤比例明显高于野生组（14.1% vs.4.8%）。
　　结论：BRAFV600E突变可能与甲状腺外侵犯、高MACIS评分、高侵袭性病理亚型、高TNM分期有关，提示预后不良。与颈淋巴结转移可能没有相关性，在预测淋巴结转移风险上需结合临床及病理特征进一步探讨。
　　第三部分BRAFV600E突变与组织NIS蛋白表达的相关性研究
　　目的：研究BRAFV600E突变与PTC组织NIS蛋白表达的相关性，及临床、组织病理特征对该相关性的影响。
　　方法：收集新鲜手术标本，Western Blotting方法检测NIS总蛋白及膜蛋白表达量；RT-qPCR检测NIS基因SLC5A5的mRNA表达量；分析癌灶与癌旁、BRAFV600E突变组
　　与野生组在实验结果上的差异。取石蜡切片行免疫组织荧光，分析NIS蛋白表达位置；免疫组化染色，分析NIS蛋白表达位置和表达量，IPP6.0软件计算NIS蛋白表达量，统计学分析影响NIS蛋白表达的临床病理特征，分析BRAFV600E突变与NIS蛋白表达的相关性。
　　结果：1. WesternBlotting显示，癌旁组织NIS总蛋白量低于癌组织，但膜蛋白量高于癌组织；突变组的NIS总蛋白及膜蛋白量均低于野生组，但无统计学差异；2. RT-qPCR显示，癌旁组织NIS-mRNA表达量低于癌组织，突变组NIS-mRNA表达量低于野生组，没有统计学差异；3.免疫荧光显示，癌旁组织可见NIS膜表达，癌组织未见明显膜表达。突变组NIS荧光强度低于野生型组；4.免疫组化分析，癌组织细胞NIS多见胞浆表达，核表达及膜表达较少；临床病理特征（年龄、性别、各项血清学检验水平、肿瘤直径、多灶性、淋巴结转移、合并良性肿瘤、合并HT）对NIS蛋白表达无明显影响。BRAFV600E突变是抑制NIS蛋白表达的因素，多因素调整年龄、合并HT、血清学相关检验水平后，仍是抑制作用，但差异不显著（β=-0.0195，p=0.085）。在不合并HT的亚组，突变是抑制NIS表达的独立因素（β=-0.0257，p=0.046），在合并HT的亚组中并没有明显差异（β=-0.0049，p=0.824）。
　　结论：NIS在乳头状癌中表达异常，多见胞浆表达，膜表达可能下降。BRAFV600E突变可能会导致NIS蛋白表达下降，该结果在不合并HT病例中较为明显，在合并HT由于病例数较少，结果有待进一步探讨。且该结果在NIS功能表达上是否成立亦须讨论。在利用BRAFV600E突变评价患者131I疗效时，在不合并HT的患者中可能更有意义。

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缩略词表

中文摘要

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前言

第一部分BRAFV600E突变联合临床特征对PTC诊断的提示意义

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 BRAFV600E 突变联合临床病理特点对PTC 预后的提示意义

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分BRAFV600E突变与组织NIS蛋白表达的相关性研究

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

全文小结

综述: BRAFV600E突变与甲状腺乳头状癌相关性研究进展

致谢