Kupffer细胞中microRNA-155的缺失减轻小鼠肝脏部分热缺血再灌注损伤

摘要

第一部分小鼠肝脏部分热缺血再灌注损伤对肝脏miR-155表达的影响
　　目的：探讨小鼠肝脏部分热缺血再灌注损伤对缺血肝组织miR-155表达的影响。
　　方法：取野生型 C57BL/6（WT）小鼠，将其随机分为两组：假手术组及手术组，每组20只，建立肝脏部分热缺血再灌注损伤模型。假手术组（sham），不阻断肝脏左叶、中叶血流，其余所有操作同手术组；手术组(I/R)，阻断肝脏左叶、中叶血流1小时后，松开血管夹，开放血流，进行再灌注。缺血1小时再灌注6小时后，评估小鼠存活率，并采集全血血浆检测谷丙转氨酶（alanine aminotransferase, ALT）及谷草转氨酶（aspertate aminotransferase, AST）水平以评估肝功能和缺血肝脏标本行HE染色，评价肝脏损伤程度，并且根据Suzuki’s标准，将肝脏损伤情况半定量进行统计学分析。通过TaqMan探针对肝组织进行逆转录实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测缺血再灌注损伤对miR-155表达的影响。结果：小鼠缺血1小时再灌注6小时后，两组小鼠存活率均达95％以上，可以达到实验要求。小鼠肝脏经历部分热缺血再灌注损伤后，出现明显的肝功能损害，手术组ALT和AST比假手术组明显升高（P<0.0001）。肝脏损伤病理显示：假手术组，小鼠肝组织结构基本正常，小叶中央静脉，肝细胞索结构清晰，肝脏无淤血，细胞无变性坏死，肝窦排列整齐，未见炎性细胞浸润。手术组小鼠肝脏经历1小时缺血6小时再灌注后，可见肝脏明显淤血，肝细胞索紊乱排列，不同程度的水肿变性和空泡状变，可见大量片状坏死灶，伴有炎性细胞浸润。与假手术组相比，手术组Suzuki’s评分显著增高，差异具有统计学意义（P<0.0001）。与假手术组相比较，手术组小鼠肝脏缺血再灌注后损伤肝脏组织中miR-155的表达明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。
　　结论：我们成功建立了小鼠部分热缺血再灌注损伤模型，缺血再灌注损伤增加肝脏miR-155的表达。
　　第二部分 miR-155缺失减轻小鼠肝脏部分热缺血再灌注损伤与Kupffer细胞有关
　　目的：探讨miR-155缺失是否通过调节Kupffer细胞进一步减轻小鼠肝脏部分热缺血再灌注损伤。
　　方法：采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）行microRNA-155基因敲除（miR-155-/-）小鼠鉴定。将小鼠分为四组:（1）WT小鼠对照组：WT小鼠于手术前24小时尾静脉注射与实验组小鼠等量的磷酸盐缓冲液，（2）miR-155-/-小鼠对照组：miR-155-/-小鼠于手术前24小时尾静脉注射与实验组小鼠等量的磷酸盐缓冲液，（3）WT小鼠实验组：WT小鼠于手术前24小时尾静脉注射GdCl3溶液（10 mg/kg），（4）miR-155-/-小鼠实验组：miR-155-/-小鼠于手术前24小时尾静脉注射 GdCl3溶液（10 mg/kg）。对各组小鼠进行肝脏部分热缺血再灌注损伤手术，缺血1小时再灌注6小时后，采集全血血浆检测ALT及AST水平以评估肝功能，将缺血肝脏标本行HE染色，评价肝脏损伤程度，并且根据Suzuki’s标准，将肝脏损伤情况半定量进行统计学分析。
　　结果：WT小鼠阳性条带为465bp，miR-155-/-小鼠阳性条带为600bp。经尾静脉注射GdCl3溶液的WT小鼠和miR-155-/-小鼠，ALT和AST水平显著低于相应对照组小鼠转氨酶水平，差异具有统计学意义（P<0.0001）。并且，注射 GdCl3溶液的WT小鼠和miR-155-/-小鼠的转氨酶水平没有明显差异，差异没有统计学意义（P>0.05）。而注射磷酸盐缓冲液的WT小鼠，ALT和AST水平显著高于注射磷酸盐缓冲液的miR-155-/-小鼠的转氨酶。两实验组肝脏病理学切片与相应的对照组相比，组织损伤明显减弱。WT小鼠对照组术前24小时腹腔注射磷酸盐缓冲液，肝脏经历缺血再灌注后，可见肝脏明显淤血，肝细胞索紊乱排列，不同程度的水肿变性和空泡状变，可见片状坏死，伴有炎性细胞浸润。miR-155-/-小鼠对照组，肝脏损伤较 WT小鼠对照组显著减弱，Suzuki’s评分显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。实验组，WT小鼠和miR-155-/-小鼠肝组织结构破坏减少，可见少许灶状坏死及点状细胞变性坏死，大部分的小叶中央静脉及肝细胞索结构尚清晰，肝脏淤血减弱，肝窦排列整齐，炎性细胞浸润明显减少。
　　结论：miR-155缺失通过作用于 Kupffer细胞，进一步减轻肝脏部分热缺血再灌注损伤。
　　第三部分miR-155缺失通过调节Kupffer细胞极化减轻小鼠肝脏部分热缺血再灌注损伤
　　目的：探讨miR-155缺失减轻小鼠肝脏部分热缺血再灌注损伤与其调节Kupffer细胞极化的关系。
　　方法：对WT小鼠及miR-155-/-小鼠做肝脏部分热缺血再灌注损伤，缺血1小时再灌注6小时后,采集全血血浆检测ALT及AST水平以评估肝功能,将缺血肝脏标本行HE染色，评价肝脏损伤程度，并且根据Suzuki’s标准，将肝脏损伤情况半定量进行统计学分析。用TUNEL技术，检测组织中肝细胞凋亡的情况。qRT-PCR检测肝组织中炎性因子mRNA表达水平。密度梯度离心法分离小鼠肝脏中Kupffer细胞，流式细胞术检测肝脏缺血再灌注损伤后 Kupffer细胞的表型及分型差异。提取 WT小鼠及miR-155-/-小鼠腹腔巨噬细胞，并贴壁纯化，将细胞分4组：A组：WT小鼠腹腔巨噬细胞未刺激组，B组：miR-155-/-小鼠腹腔巨噬细胞未刺激组，C组：WT小鼠腹腔巨噬细胞+ LPS（50ng/ml）刺激24小时，D组：miR-155-/-小鼠腹腔巨噬细胞+ LPS（50ng/ml）刺激24小时。收集每组细胞，流式检测腹腔巨噬细胞表型及分型的差异；ELISA检测腹腔巨噬细胞培养液中TNF-α和IL-10浓度。Transwell共培养研究 Kupffer细胞和巨噬细胞对肝细胞凋亡的影响。
　　结果：miR-155-/-小鼠组ALT和AST水平明显低于WT小鼠组。肝脏组织病理学切片显示：与WT小鼠组相比，miR-155-/-小鼠组肝脏组织坏死区域明显减小，淤血也较少，肝组织结构破坏明显减弱。WT小鼠组肝组织淤血明显增强，肝细胞索严重破坏，可见多个片状坏死区域。与WT小鼠组相比，miR-155-/-小鼠组Suzuki’s评分显著降低，差异具有统计学意义（P<0.001），并且凋亡的肝脏细胞也显著减少（P<0.05）。缺血再灌注损伤后，两组小鼠肝脏中炎性因子的表达水平均明显升高，miR-155-/-小鼠肝脏TNF-α的表达水平明显低于WT小鼠，而miR-155-/-小鼠肝脏IL-10的表达水平明显高于WT小鼠。肝脏缺血再灌注后，miR-155-/-小鼠组Kupffer细胞CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达水平明显低于WT组小鼠，差异具有统计学意义（P<0.05）。miR-155-/-小鼠组，M1型（CD11c+CD206-） Kupffer细胞较 WT组明显减少，而 M2型（CD11c-CD206+）Kupffer较WT组却明显增多，差异具有统计学意义（P<0.05）。分离纯化的腹腔巨噬细胞纯度>90%，可以满足实验需要。无LPS刺激组（PBS孵育组），miR-155-/-小鼠来源的腹腔巨噬细胞CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达明显低于WT小鼠来源的巨噬细胞，差异具有统计学意义（CD80 P<0.01；CD86 P<0.05; MHC-ⅡP<0.05）。经LPS刺激后，两种小鼠来源的巨噬细胞CD80、CD86、CD40和MHC-Ⅱ的表达均明显升高，但是，miR-155-/-小鼠来源的腹腔巨噬细胞 CD80、CD86、CD40和MHC-Ⅱ的表达水平与WT小鼠组相比明显降低，差异显著（CD80 P<0.01；CD86 P<0.05; CD40 P<0.01；MHC-ⅡP<0.05）。无LPS刺激组，miR-155-/-小鼠来源的腹腔巨噬细胞M1型（CD11c+CD206-）细胞比例显著低于WT小鼠组（P<0.01），而其M2型（CD11c-CD206+）细胞比例却显著高于WT小鼠组（P<0.05）。经LPS刺激后，两种小鼠来源的巨噬细胞 M1型细胞比例均升高，M2型细胞比例均降低。但是，miR-155-/-小鼠组M1型细胞比例明显低于WT小鼠组相比，M2型细胞比例明显高于WT小鼠组，差异具有统计学意义（M1 P<0.05，M2 P<0.01）。LPS刺激后，巨噬细胞培养上清中TNF-α和IL-10浓度均明显升高，miR-155-/-小鼠组巨噬细胞培养上清中TNF-α的浓度明显低于 WT小鼠组，而 miR-155-/-小鼠组巨噬细胞培养上清中 IL-10的浓度明显高于WT小鼠组，差异具有统计学意义（P值均小于0.05）。巨噬细胞和Kupffer细胞加速肝细胞凋亡；miR-155-/-小鼠来源的Kupffer细胞较 WT小鼠来源的Kupffer细胞对肝细胞促凋亡作用明显减弱，差异具有统计学意义（P<0.05）。
　　结论：miR-155缺失可以通过调节Kupffer细胞，抑制其向M1型分化，而促进其向M2型分化，减少炎性因子TNF-α分泌，而促进IL-10的分泌，减弱肝细胞凋亡及肝脏炎性反应，进一步改善肝脏缺血再灌注损伤。

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封面

声明

目录

缩写及中英文对照

前言

参考文献

中文摘要

英文摘要

第一部分 小鼠肝脏部分热缺血再灌注损伤对肝脏miR-155表达的影响

引言

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四．讨论

参考文献

第二部分 miR-155缺失减轻小鼠肝脏部分热缺血再灌注损伤与Kupffer细胞有关

引言

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

参考文献

第三部分miR-155缺失通过调节Kupffer细胞极化减轻小鼠肝脏部分热缺血再灌注损伤

引言

一、实验材料

二、实验方法

三、结果

四．讨论

参考文献

综述: 肝脏缺血再灌注损伤研究现状

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