SCF/c-kit信号途径通过GRK6转激活CXCR4并调控心脏干细胞的迁移

摘要

大量的研究表明，在正常成年人和鼠心脏内含有原始的、未分化的Lin(-) c-kit(+)干细胞，它们分布广泛并维持着心脏内部的稳态，被认为是心脏干细胞(Cardiac stem cell, CSC)。我们以往的研究发现，在大鼠心肌梗死模型中，受损心肌细胞高度表达干细胞因子(stem cell factor, SCF)，SCF及其位于 CSC表面的受体 c-kit构成的SCF/c-kit信号介导了 CSC向梗死区的迁移并改善了心功能。在实验过程中，我们试图通过阻断 SCF/c-kit的下游信号 p38 MAPK来阻断CSC的迁移，但出人意料的是，阻断 p38 MAPK并未能完全阻断 CSC的迁移，提示可能还有其他信号因子发挥了调控CSC迁移的作用。CSC除了表达c-kit之外，还表达另外一个与趋化相关的受体 CXCR4。有报道称，CXCR4在没有其配体基质衍生因子1（SDF-1）存在的情况下，仍然可以被其它的受体信号转激活，从而发挥作用。但是 SCF/c-kit信号是否能够转激活 CXCR4，从而影响细胞的迁移呢？这一点并不清楚。本研究旨在探讨CXCR4转激活在SCF/c-kit诱导的CSC迁移中的作用及机制，论文分为3个部分：
　　第一部分：心脏干细胞的培养分离和鉴定。利用原代组织块培养的技术，从C57BL/6小鼠心脏中分离出 c-kit阳性的心脏干细胞，并在体外予以扩增培养。通过流式细胞仪和免疫荧光的检测，CSC为c-kit和CXCR4双阳性细胞，并且长期的体外培养也基本不影响c-kit和CXCR4的表达，说明可以用于后续的实验。另外，分离出的CSC在体外用地塞米松进行诱导培养，CSC可以成功的向心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞分化，说明CSC具有多向分化的潜能。
　　第二部分：CXCR4的转激活在SCF/c-kit信号诱导的CSC迁移中的作用。首先，我们用SCF刺激CSC，通过Transwell和Western Blotting的方法来观察SCF/c-kit信号激活后对CSC迁移及与迁移相关MAPK信号的影响。然后用CXCR4的siRNA沉默CSC中CXCR4的表达，观察CSC的迁移在沉默CXCR4之后的改变。已只CXCR4激活后可引起起丝氨酸339位点的磷酸化，于是，我们用SCF刺激CSC，观察SCF/c-kit信号是否能够转激活CXCR4，并引起其丝氨酸339位点磷酸化的变化。接下来，我们构建CXCR4丝氨酸339位点缺失突变的模型，研究CXCR4丝氨酸339位点的缺失对SCF/c-kit信号的影响。结果显示：SCF能够诱导CSC的迁移以及增强CXCR4丝氨酸339位点、p38 MAPK和ERK1/2的磷酸化。沉默CXCR4之后后，SCF/c-kit信号引起的CSC的迁移、p38 MAPK及ERK1/2的磷酸化也随之降低。在HEK293细胞系中，CXCR4丝氨酸339位点的缺失也会影响SCF/c-kit信号诱导的细胞迁移。
　　第三部分：G protein-coupled receptor kinase6（G蛋白受体激酶6，GRK6）调控CXCR4丝氨酸339位点的磷酸化并影响SCF/c-kit信号介导的CSC的迁移。根据报道，GRK6在 CXCR4磷酸化的过程中起到了重要的作用，所以我们用 GRK6的质粒或siRNA使CSC中GRK6的表达量升高或降低，来观察其在SCF/c-kit信号中是否会影响CXCR4丝氨酸339位点的磷酸化以及细胞的迁移。之后我们在体内进行实验验证，在小鼠的心肌梗死模型中，我们沉默GRK6之后观察CSC向梗死区迁移量的改变。结果显示：沉默GRK6减弱SCF/c-kit诱导的CXCR4丝氨酸的磷酸化、CSC的迁移以及MAPK的激活；而高表达GRK6则是相反的结果。另外，在小鼠心肌梗死模型中，沉默GRK6也影响CSC向梗死区迁移的能力。
　　综上所述，c-kit和CXCR4在CSC中存在信号和功能上的交流。SCF/c-kit信号通过GRK6能够转激活CXCR4，并且诱导其丝氨酸339位点的磷酸化，共同调节CSC的迁移和下游信号MAPK的激活。c-kit和CXCR4这两个受体信号通路都和CSC参与心肌修复有关，它们之间交流都机制为“动员 CSC修复受损心脏”提供了治疗策略和理论依据。

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第一部分 心脏干细胞的培养分离和鉴定

摘要

Abstract

前言

1. 材料与方法

2. 实验结果

3. 讨 论

参考文献：

第二部分CXCR4的转激活在SCF/c-kit信号诱导的CSC迁移中的作用

【摘 要】

Abstract

前言

1. 材料与方法

2. 实验结果

3. 讨 论

参考文献:

第三部分GRK6调控SCF/c-kit信号介导的CXCR4磷酸化和CSC的迁移

【摘要】

Abstract

前言

1. 材料与方法

2. 实验结果

3. 讨 论

参考文献:

全文总结

综述: 干细胞治疗在心脏修复和再生中的研究进展

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