IFN-γ诱导自噬不足通过p62蛋白引起慢性鼻-鼻窦炎中上皮细胞凋亡的研究

摘要

研究背景：自噬是细胞内通过溶酶体途径吞噬、降解老化的细胞器或入侵的细菌，病毒等，在细胞的生长，分化，抵御外界刺激，质量平衡方面发挥着重要的作用。但是如果自噬不足或自噬障碍则与疾病的发生密切相关。此外，目前自噬状态或改变在慢性鼻鼻窦炎伴鼻息肉的疾病中研究的很少。
　　研究目的：研究自噬流相关蛋白在慢性鼻窦炎伴鼻息肉中定位及表达，以及其与上皮细胞凋亡的研究。
　　研究方法：（1）免疫组化及免疫印记方法(western blot; WB)检测慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉组织及上皮细胞中自噬及凋亡相关蛋白表达：与自噬相关的蛋白包括：微管相关蛋白1的轻链3β-Ⅱ(microtubule-associated protein1 light chain3B(LC3B)-Ⅱ),自噬相关蛋白3，5,7（autophagy-related protein(Atg)3, Atg5, Atg7）；B淋巴细胞-2相互作用蛋白(Bcl-2 interacting protein; Beclin1)；底物蛋白p62蛋白,泛素化蛋白（ubiquitinated protein）；溶酶体标志物：溶酶体相关膜蛋白（lysosomal-associated membrane protein1; LAMP-1).凋亡相关蛋白包括含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3，-8（cysteine-aspartic protease(caspase)-3；caspase-8）；聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（poly-ADP-ribose polymerase；PARP）.
　　（2）电镜观察慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉组织及上皮细胞自噬体及自噬溶酶体数量的改变。
　　（3）western blot检测慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉上皮细胞中自噬流的变化：分别用自噬抑制剂巴弗洛霉素A1（bafilomycin A1；Baf A1）和自噬激动剂雷帕霉素(rapamycin; Rapa)来刺激慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉上皮细胞，观察自噬流（LC3B, p62）及凋亡(cleaved PARP)的改变。
　　（6）western blot检测siNS或sip62后慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉上皮细胞中凋亡的改变：用20 nM siNS或 sip62转染鼻息肉上皮细胞，48小时后观察 p62, caspase-8, caspase-3的表达变化。
　　（7）刺激BEAS-2B细胞系筛选引起鼻息肉上皮细胞中自噬不足的上游因子：分别用白介素（interleukin（IL）-4,-13,-17A）或干扰素-γ（interferon–gamma；IFN-γ）或聚肌苷酸-聚胞苷酸（polyinosinic: polycytidylic acid；poly(I:C)；dsRNA）, or脂多糖（lipopolysaccharides；LPS）刺激BEAS-2B细胞系，western blot观察LC3B, p62, ubiquitinated proteins,及凋亡的改变。
　　（8）筛选出的INF-γ刺激正常鼻粘膜上皮细胞（nasal epithelial cells；NECs）观察自噬和凋亡的改变：用IFN-γ刺激正常鼻粘膜上皮细胞（NECs）,通过western blot检测观察LC3B, p62, ubiquitinated proteins的表达,western blot及Anexin V/PI观察凋亡的改变。
　　(9) IFN-γ刺激后WB检测正常鼻粘膜上皮细胞中自噬流的变化：用rapamycin预先处理上皮细胞3小时后，再用IFN-γ刺激，或先IFN-γ刺激上皮细胞24小时，于收集细胞前加入bafilomycin A1刺激3小时，western blot检测自噬流（LC3B, p62）及cleaved PARP的改变；Anexin V/PI检测凋亡的改变。
　　(10)转染siNS或sip62, siAtg5到正常鼻粘膜上皮细胞,再IFN-γ刺激后观察p62及凋亡的改变：转染20 nMsiNS或sip62,或60 nMsiAtg5到正常鼻粘膜上皮细胞后,再IFN-γ刺激24小时，观察p62蛋白及凋亡的改变。
　　研究结果：（1）自噬相关蛋白LC3B-II, Atg3, Atg5, Atg7, Beclin1；自噬底物蛋白p62, ubiquitinated蛋白；溶酶体标记物 LAMP-1,以及凋亡相关蛋白 cleaved caspase-8, caspase-3and PARP在嗜酸粒细胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻窦炎和非嗜酸粒细胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻窦炎的组织，及鼻粘膜上皮细胞中，相较于正常组，均表达增加。
　　（2）加入自噬抑制剂bafilomycin A1引起鼻息肉上皮细胞中LC3B-Ⅱ，p62, cleaved PARP的蛋白表达水平均升高，而加入自噬激动剂rapamycin仅引起LC3B-Ⅱ轻微升高，p62, cleaved PARP相应的出现轻微的降低，均相对于对照组无统计学意义，提示在鼻息肉上皮细胞中自噬是升高的，而且自噬流的通路是无障碍的。
　　（3）用转染技术转染sip62到鼻息肉上皮细胞中，我们观察到相应的外源性的凋亡通路cleaved caspase8, cleaved PARP的蛋白水平均出现降低。
　　（4）分别用白介素 IL-4, IL-13, IL-17A或 IFN-γ或 dsRNA,或 LPS刺激BEAS-2B细胞系，筛选出 INF-γ可能是鼻息肉上皮细胞中自噬不足的上游影响因素。再用INF-γ刺激气液界面培养的正常原代鼻黏膜上皮细胞，我们发现与刺激BEAS-2B细胞系的结果类似，自噬标志蛋白LC3B-Ⅱ出现增高；而其底物蛋白p62, ubiquitinated蛋白反而也出现增高。为进一步证实是否存在自噬不足，我们再次加入自噬抑制剂bafilomycin A1到INF-γ刺激的正常鼻粘膜上皮细胞，发现上皮细胞中LC3B-Ⅱ，p62, cleaved PARP的蛋白表达水平均升高，而加入自噬激动剂rapamycin仅引起LC3B-Ⅱ轻微升高，p62, cleaved PARP相应的出现轻微的降低，均相对于对照组无统计学意义，IFN-γ刺激正常鼻粘膜上皮细胞与鼻息肉上皮细胞出现的自噬不足的状态类似。
　　（5）为进一步证实 IFN-γ通过 p62蛋白诱导上皮细胞凋亡，我们分别 sip62或siAtg5到正常鼻粘膜原代上皮细胞，再用IFN-γ刺激。我们发现sip62+IFN-γ相较于siNS+IFN-γ，cleaved PARP及capase-8的表达明显降低，差异具有统计学意义；而siAtg5后p62表达上调，所以siAtg5+IFN-γ相较于siNS+IFN-γ，cleaved PARP及capase-8的表达明显增加，差异具有统计学意义。所以在鼻粘膜上皮细胞中IFN-γ可能通过p62蛋白影响上皮细胞凋亡。研究结论：1. IFN-γ在嗜酸粒细胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻窦炎和非嗜酸粒细胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻窦炎组织中均表达增高。而且凋亡在嗜酸粒细胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻窦炎和非嗜酸粒细胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻窦炎上皮细胞中均表达增高。
　　2.增高的IFN-γ可能通过诱导自噬不足引起 p62蛋白的上调，进而通过增高的p62蛋白激活外源性的凋亡通路，引起慢性鼻-鼻窦炎上皮细胞的凋亡。

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前言

实验方法

1 研究对象：

2 免疫组织化学实验方法：免疫组化方法根据先前的文献报道进行（22）

3. 透射电镜术: 组织处理步骤与其他文献报道的一样（23）。

4.细胞系（BEAS-2B）及鼻粘膜原代上皮细胞 (NECs)培养及处理方法：

5.蛋白免疫印迹杂交方法（western blot）：

6.凋亡Annexin V/propidium iodide (PI)流式检测：

7.统计学分析：

实验结果

1. 嗜酸粒细胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻窦炎和非嗜酸粒细胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻窦炎组织中相对于正常下鼻甲组织自噬相关蛋白，p62 蛋白，及凋亡蛋白均表达上调

2. 嗜酸粒细胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻窦炎和非嗜酸粒细胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻窦炎上皮细胞中相对于正常中鼻甲上皮细胞中自噬相关蛋白，p62 蛋白，及凋亡蛋白均表达上调

3. 嗜酸粒细胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻窦炎和非嗜酸粒细胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻窦炎鼻息肉上皮细胞自噬不足引起依赖p62蛋白的上皮细胞凋亡

4. 在正常鼻粘膜原代上皮细胞中IFN-γ可以引起自噬不足，并且通过增高的p62蛋白诱导细胞凋亡

讨论

参考文献

第二部分.综述: 自噬的发生及与疾病的联系

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