HCN2亚基介导的自噬调节对HT22细胞系氧糖剥夺再灌注损伤的保护作用及其机制研究

摘要

目的：本实验旨在观察HCN通道在小鼠海马神经元 HT22细胞系氧糖剥夺再灌注（OGD-Rep）所致损伤中的作用及其对自噬的调控，并进一步探究其分子机制。
　　方法：采用离体水平氧糖剥夺再灌注（OGD-Rep）模型模拟在体水平脑缺血再灌注损伤；细胞活力实验和细胞流式检测评价OGD-Rep对HT22细胞的损伤作用及HCN通道的特异性阻断剂ZD7288（4-(N-Ethyl-N-phenylamino)-1,2 dime-thyl-6-(methylamino) pyrimidinium chloride, ZD7288）的药理作用；采用慢病毒转染技术特异性沉默HCN2亚基蛋白；采用免疫荧光技术检测：①慢病毒对HCN2亚基的特异性沉默，②ZD7288对OGD-Rep诱导自噬的调节作用；Western blotting技术检测相关蛋白变化：①慢病毒对HCN1和HCN2蛋白的沉默作用；②LC3-II、p-mTOR、BECN1和 p62等自噬相关蛋白表达；应用自噬溶酶体阻断剂氯喹（CQ）检测ZD7288对自噬小体降解的影响。
　　结果：在氧糖剥夺再灌注损伤模型下，OGD(6 h)-Rep(12 h)组细胞活力下降至（50.53±1.02）%；ZD7288(10μM)显著缓解氧糖剥夺再灌注损伤诱导细胞活力下降和细胞凋亡；OGD-Rep模型显著上调HCN2亚基表达而对HCN1亚基蛋白表达无影响；慢病毒shHCN2对HT22细胞系具有较高效率转染及对HCN2通道蛋白具有较好的特异性沉默作用；ZD7288和shRNA作用效果一致，能显著逆转OGD-Rep诱导LC3 II和ATG5蛋白高表达与p-mTOR和p62蛋白下调；ZD7288和sh-HCN2对OGD-Rep诱导自噬的作用均能被CQ取消。
　　结论：在氧糖剥夺再灌注模型下，HCN通道阻断剂通过阻断HCN2亚基促进自噬小降解从而发挥对HT22细胞系的神经保护作用。

目录

声明

英文缩略语

前言

材料和方法

一. 实验材料

1. 实验细胞

2. 实验仪器

3. 实验材料和试剂

4. 主要试剂的配制：

1. HT22细胞系传代与复苏

2. HT22细胞系冻存

3. HT22细胞系OGD-Rep模型建立

4. 慢病毒沉默HT22细胞系HCN2通道

5. HT22细胞系活力测定

6. HT22细胞系凋亡检测

7. 细胞免疫荧光

8. Western blotting

9. 统计学分析

结果

（一）不同缺血时间点的OGD-Rep对HT22细胞系的损伤作用

（二）不同浓度HCN通道阻断剂对OGD-Rep损伤的保护作用

（三）OGD-Rep损伤对HT22细胞系HCN1和HCN2亚型表达的影响

（四）sh-HCN2对HT22细胞系转染效率和沉默效率的验证

（五）HCN通道阻断剂对OGD-Rep损伤诱导自噬的调节作用

（六）HCN通道阻断剂通过HCN2亚基促进OGD-Rep模型诱导自噬小体降解

讨论

参考文献

全文总结及创新点

综述:自噬在急性脑损伤疾病中的作用

附录一 硕士研究生期间发表论文

附录二 硕士研究生期间获得奖励

致谢