miR-203a和miR-203b基因在食管鳞状细胞癌中的表达及其甲基化状态分析

摘要

目的:食管癌是发生在食管粘膜上皮的恶性肿瘤，根据食管癌的组织学特点可分为五种类型，其中食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cellcarcinoma，ESCC)在食管癌中所占比例最多，大约占90％，食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，EA)次之，占7％左右，其他几种类型均少见。我国是世界上食管癌发生率和病死率均较高的国家之一，同时食管癌预后特别差，晚期患者生存率极低。然而到目前为止，食管癌的发病机制尚不清楚。
　　近年来对食管癌的发病机制已进行广泛研究，其中对表观遗传学的改变特别是miRNAs启动子区高甲基化已成为研究的热点，本研究通过检测miR-203a和miR-203b基因在食管癌细胞和食管鳞癌组织中的表达及其甲基化状态，探讨miR-203a和miR-203b基因甲基化与食管癌发生、发展的关系，从而为食管癌发病的分子机制、治疗方案及其评估预后等方面提供新的理论依据。
　　方法:
　　1、应用实时定量RT-PCR(Quantitative real-time RT-PCR，qRT-PCR)方法检测应用DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycitydine，5-aza-dC)处理前后的食管癌细胞系(TE1、TE13、YES-2、ECa109和T.TN)和54例食管鳞癌组织及其相应的癌旁组织中miR-203a和miR-203b基因的表达。
　　2、应用甲基化特异性PCR(methylation specific polymerase chainreaction，MSP)方法检测应用5-aza-dC处理前后的食管癌细胞系和83例食管鳞癌组织及其相应的癌旁组织中miR-203a和miR-203b基因的甲基化状态。
　　3、运用统计软件SPSS19.0对数据进行统计学分析。
　　结果:
　　1、miR-203a基因在食管癌中的表达及甲基化
　　1.1食管癌细胞系中miR-203a基因的表达及甲基化状态
　　未经5-aza-dC处理，五种食管癌细胞中miR-203a基因的表达均相对较低，且呈高甲基化状态;5-aza-dC处理后，miR-203a基因的表达均显著升高（均P＜0.05），YES-2细胞中miR-203基因甲基化程度显著降低，其余4种食管癌细胞系中miR-203a基因为非甲基化状态。
　　1.2食管癌组织中miR-203a基因的表达
　　miR-203a基因在食管癌和其相应的癌旁组织的表达量分别为0.253±0.099和0.481±0.189，食管癌组织miR-203a基因的表达量明显低于其相应的癌旁组织，两者的差异有统计学意义（t=-14.137，P=0.000）。在食管鳞癌患者中，miR-203a的表达与肿瘤组织的肿瘤分期和分化程度有关(P＜0.05)，而与患者的年龄、性别和淋巴结转移无关(P＞0.05)。
　　1.3食管癌组织中miR-203a基因甲基化状态的研究
　　miR-203a基因启动子区在食管鳞癌组织和其相应的癌旁组织的甲基化率分别62.7％(52/83)和7.2％(6/83)。食管鳞癌组织中miR-203a基因启动子区甲基化发生率明显高于其相应的癌旁组织（x2=3.918，P=0.048）。miR-203a基因在低分化鳞癌组中甲基化发生率75.0％(33/44)明显高于中高分化鳞癌组甲基化发生率48.7％(19/39)（x2=6.103，P=0.013）;Ⅲ期和Ⅳ期miR-203a基因启动子区的甲基化发生率94.1％(16/17)明显高于Ⅰ期和Ⅱ期54.5％(36/66)（x2=9.047，P=0.003）;miR-203a基因启动子区甲基化发生率与患者的年龄、性别和淋巴结转移无关(P＞0.05)。
　　1.4食管癌组织中miR-203a基因的表达、甲基化状态及其与临床病理资料之间的关系
　　在miR-203a基因启动子区发生甲基化的食管鳞癌组织中，其平均相对表达量为0.232±0.818，未发生甲基化的食管鳞癌组织中平均相对表达量为0.313±0.120，两者差异有统计学意义(P=0.006)。
　　2、miR-203b基因在食管癌中的表达及甲基化
　　2.1食管癌细胞系中miR-203b基因的表达及甲基化状态
　　未经5-aza-dC处理的5种食管癌细胞系中miR-203b基因的表达均相对较低，同时表现为高甲基化状态;而应用5-aza-dC处理后，miR-203b在YES-2和T.TN细胞中的甲基化程度降低，非甲基化程度增加，其余3种食管癌细胞系中miR-203b基因均表现为非甲基化状态。
　　2.2食管癌组织中miR-203b基因的表达
　　miR-203b基因在食管癌和其相应的癌旁组织的表达量分别为0.026±0.021和0.049±0.041，食管癌组织miR-203b基因的表达明显低于其相应的癌旁组织，两者的差异有统计学意义(t=7.810，P=0.000)。在食管鳞癌患者中，miR-203b的表达与肿瘤组织的分化程度有关(P＜0.05)，而与患者的年龄、性别、淋巴结转移和肿瘤组织的分期无关（P＞0.05）。
　　2.3食管癌组织中miR-203b基因甲基化状态的研究
　　miR-203b基因启动子区在食管鳞癌组织和其相应的癌旁组织中的甲基化率分别57.8％(48/83)和12.0％(10/83)。食管鳞癌组织中miR-203b基因启动子区甲基化发生率明显高于其相应的癌旁组织（x2=6.673，P=0.010）。miR-203b基因在低分化鳞癌组甲基化发生率68.2％(30/44明显高于中高分化鳞癌组甲基化发生率46.2％(18/39)（x2=4.114，P=0.043）;miR-203b基因启动子区甲基化发生率与年龄、性别、淋巴结转移和肿瘤组织分期无关（P＞0.05）。
　　2.4食管癌组织中miR-203b基因的表达、甲基化状态及其与临床病理资料之间的关系
　　在miR-203b基因启动子区发生甲基化的食管鳞癌组织中，其平均相对表达量是0.017±0.013，未发生甲基化的食管鳞癌组织中平均相对表达量是0.036±0.025，两者差异有统计学意义(P=0.001)。
　　结论:
　　1、miR-203a和miR-203b在食管癌细胞系中表达较低，且呈现为高甲基化状态，5-aza-dC能逆转miR-203a和miR-203b基因的甲基化，使miR-203a和miR-203b恢复表达，提示miR-203a和miR-203b基因启动子区异常甲基化有可能是导致它们在食管癌细胞中表达缺失的重要机制之一。
　　2、miR-203a和miR-203b基因在食管鳞癌组织中的表达明显低于其相应的癌旁组织，提示miR-203a和miR-203b基因在食管鳞癌中可能主要起抑癌基因的作用。
　　3、食管鳞癌组织中miR-203a和miR-203b基因启动子区甲基化情况明显高于其相应的癌旁组织，提示miR-203a和miR-203b基因甲基化可能是食管鳞癌发生的机制之一。
　　4 miR-203a和miR-203b启动子区甲基化情况与患者年龄，性别等因素无关，与分化程度等生物学行为有关，提示miR-203a和miR-203b基因启动子区甲基化与食管鳞癌的预后可能有关。

目录

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摘要

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前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 miR-203a在肿瘤中的研究进展

致谢

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