组蛋白去乙酰化酶抑制剂联合三氧化二砷对HL-60细胞增殖、凋亡的影响及机制研究

摘要

目的：急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一类起源于造血干细胞的血液系统恶性肿瘤。目前联合化疗以及化疗基础上的造血干细胞移植是治疗AML的主要方法，但存在原发耐药、复发难治、化疗毒副作用大、移植供者局限及GVHD(移植物抗宿主病)等诸多问题，最终导致治疗的失败。为提高治疗的效果，减轻传统化疗的毒副作用及交叉耐药等弊端，新的治疗药物及作用靶点急需被探索。端粒酶是一种逆转录酶，依靠其自身RNA为模板，以逆转录方式延长随细胞分裂逐渐缩短的端粒，从而导致细胞的永生化及癌变，在急性髓系白血病细胞中高表达，并被证实为肿瘤的特异性标志。研究表明以端粒酶为作用靶点，利用表观遗传学机制，采取改变组蛋白的乙酰化水平等方式，在不改变DNA顺序的基础上影响基因的表达，可达到抑制端粒酶活性，进而产生抑制肿瘤细胞增殖、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡等抗癌效果。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylases inhibitors, HDACi)西达本胺通过抑制组蛋白去乙酰化酶使细胞蛋白乙酰化水平提高，可选择性的调控细胞大量基因转录，产生特异性的肿瘤杀伤效应。而三氧化二砷可通过下调肿瘤细胞端粒酶的活动度、改变细胞周期蛋白和凋亡相关蛋白的表达以及抑制肿瘤内血管生成、抑制肿瘤细胞增殖、调控凋亡基因等作用，发挥治疗急性髓系白血病的作用。因此，通过改变组蛋白乙酰化水平，调控端粒酶的活性，为急性髓系白血病的治疗提供了新的思路。
　　西达本胺(Chidamide)是一种化学结构全新的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi),由我国首先自主研发而成，并被收录为国家专利，是一种新型的抗肿瘤药物，目前多以口服制剂作为临床用药途径。该药目前在多种血液系统肿瘤治疗方面已经有了应用，如皮肤T细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、血管免疫母T细胞淋巴瘤，并在多种恶性肿瘤治疗中行临床试验治疗，具有相对广泛的抗癌谱系。三氧化二砷(arsenic trioxide, AS2O3)虽为剧毒砒霜的主要成分，但早已成功进入我国传统中药的行列，对急性早幼粒细胞白血病(APL)具有明确的治疗效果，低剂量三氧化二砷可诱导分化停留于早幼粒细胞阶段的白血病细胞，高剂量三氧化二砷可产生细胞毒性，诱导白血病细胞凋亡，已成为临床治疗急性早幼粒细胞白血病的常规用药。NCCN的AML诊疗指南亦明确指出其治疗维甲酸耐药及复发难治的急性早幼粒细胞白血病的肯定疗效及治疗地位。同时，三氧化二砷在多种恶性肿瘤的放化疗治疗中，可协同促进其他药物的药效，提高放化疗的敏感性，在减轻单药大剂量用药所致的不良反应同时，可增加抗癌效果，在临床治疗中有着举足轻重的地位。
　　近年来，组蛋白去乙酰化酶抑制剂作为抗肿瘤治疗的热点研究对象，不断被应用于临床及实验研究。对于应用标准化疗方案耐药、不能耐受、难治复发型AML患者，寻求一条相对安全有效的治疗方案是目前的一个重要课题。因此，本课题应用西达本胺、三氧化二砷及两药联合作用于HL-60细胞(人急性髓系白血病细胞株)，观察西达本胺、三氧化二砷及两药联合通过作用于端粒酶逆转录酶诱导急性髓系白血病细胞凋亡的时间及量效关系，及对端粒酶活性影响的作用机制，探讨西达本胺、三氧化二砷及两药联合选择性诱导急性髓系白血病细胞凋亡的作用机制，为拓宽急性髓系白血病的临床治疗途径，提高患者总体生存率，提供更多的理论依据。
　　方法：
　　选取AML细胞株HL-60细胞作为研究对象，并随机分组：空白对照组，西达本胺单药组(0.5μmol/L、2μmol/L、4μmol/L)， AS2O3单药组(1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L)，西达本胺联合AS2O3组(0.5μmol/L+1.25μmol/L、4μmol/L+5μmol/L)。评价不同药物浓度干预不同时间后对HL-60细胞增殖、凋亡的作用以及对 HL-60细胞端粒酶亚单位hTERTmRNA(端粒酶逆转录酶mRNA)及端粒酶hTERT蛋白表达水平的影响,探讨两药的作用机制。每组实验均重复3次。
　　1.用CCK8法初筛浓度并检测不同浓度药物作用24h、48h、72h对HL-60细胞的增殖抑制率；
　　2.用流式细胞术(FCM)检测不同浓度药物作用于HL-60细胞24h、48h、72h后细胞的凋亡率；
　　3.用RT-PCR法检测不同浓度药物作用HL-60细胞48h后hTERTm RNA的表达水平；
　　4.用Western Blot(蛋白印迹)方法检测不同浓度药物作用HL-60细胞48h后端粒酶hTERT的蛋白表达水平；
　　5.统计学处理。
　　结果：
　　1.西达本胺、AS2O3对HL-60细胞增殖的影响
　　1.1.不同浓度西达本胺单药组和AS2O3单药组分别对HL-60细胞作用24h、48h、72h，随着药物作用浓度递增，HL-60细胞受到的增殖抑制作用越明显，增殖抑制率越高；随着药物作用时间的递增，HL-60细胞受到的增殖抑制作用亦越明显，增殖抑制率亦越高。西达本胺对HL-60细胞增殖抑制率由(16.01±0.34)％增加到(97.09±0.91)%，AS2O3对HL-60细胞增殖抑制率由(13.93±1.03)%增加到(84.40±1.50)%。通过统计学软件分析，对照组、不同处理组相互之间差异均具有统计学意义(P=0.00)。综上说明西达本胺单药、AS2O3单药均能够抑制HL-60细胞增殖，并具有剂量-时间依赖性。(Fig.1, Fig.2, Table1, Table2)
　　1.2.不同浓度的西达本胺、AS2O3行两药联合对HL-60细胞作用24h、48h、72h，两药高浓度联合组与两药低浓度联合组相比，增殖抑制率明显增高；随药物作用时间延长，HL-60细胞增殖抑制率亦逐渐增高，综合两种因素， HL-60的增殖抑制率由最低（70.34±1.59）%提高至最高（98.22±0.77）%。且两药联合组与单药组相比，联合组对HL-60细胞的增殖抑制作用较单药组明显增强。通过统计学软件分析，对照组、不同处理组相互之间差异均具有统计学意义(P=0.00)。说明西达本胺、AS2O3两药联合可协同抑制HL-60细胞增殖。(Fig.3, Table3)
　　2.西达本胺、AS2O3对HL-60细胞凋亡的影响
　　2.1.不同浓度的西达本胺单药组、AS2O3单药组分别对HL-60细胞作用24h、48h、72h，随着药物作用浓度递增，HL-60细胞受到的凋亡作用越显著，凋亡率越高；随着药物作用时间的递增，HL-60细胞受到的凋亡作用亦越明显，凋亡率亦越高。西达本胺作用于HL-60细胞，凋亡率由(7.30±0.47)%增加到(25.62±1.53)%，AS2O3作用于HL-60细胞，凋亡率由(12.16±1.08)%增加到(40.97±1.73)%。通过统计学软件分析，对照组、不同处理组相互之间差异均具有统计学意义(P=0.00)。说明西达本胺单药、AS2O3单药均能够诱导HL-60细胞凋亡，并具有剂量-时间依赖性。(Fig.4, Table4, Table5)
　　2.2.不同浓度的西达本胺、AS2O3行两药联合作用于HL-60细胞24h、48h、72h，两药高浓度联合组与两药低浓度联合组相比，凋亡率明显增高；随药物作用时间延长，HL-60凋亡率亦逐渐增高，综合两种因素，HL-60的增殖抑制率由最低(19.56±0.77)%提高至最高(78.72±2.47)%。且两药联合组与单药组相比，联合组对HL-60细胞的促凋亡作用较单药组明显增强。通过统计学软件分析，对照组、不同处理组相互之间差异均具有统计学意义(P=0.00)。说明西达本胺联合AS2O3对HL-60细胞具有协同促凋亡作用。(Fig.4, Table6)
　　3.西达本胺、AS2O3对HL-60细胞hTERTmRNA表达的影响
　　3.1.不同浓度的西达本胺单药组、AS2O3单药组作用HL-60细胞48h后，随着药物作用浓度递增，hTERTmRNA的表达水平逐渐下降。西达本胺作用于HL-60细胞，hTERTmRNA的表达量由0.95±0.02减少到0.72±0.05， AS2O3作用于HL-60细胞， hTERTmRNA的表达量由0.91±0.01减少到0.66±0.02。通过统计学软件分析，对照组、不同处理组相互之间差异均具有统计学意义(P=0.00)。说明西达本胺、AS2O3单药能够减少HL-60细胞hTERTmRNA的表达水平，并呈剂量依赖性。(Fig.5, Fig.6, Table7, Table8)
　　3.2.不同浓度的西达本胺联合AS2O3对HL-60细胞作用48h后，低浓度两药联合 hTERTmRNA的表达量为0.55±0.02，高浓度两药联合hTERTmRNA的表达量下降到0.15±0.02，随着药物浓度的增加， hTERTmRNA的表达量逐渐下降，各处理组与单药组及对照组比较， hTERTmRNA的表达量下降明显，通过统计学软件分析，对照组、不同处理组相互之间差异均具有统计学意义(P=0.00)。说明西达本胺联合AS2O3能够协同减少HL-60细胞hTERT mRNA的表达水平。(Fig.5, Fig.6,Table9)
　　4.西达本胺、AS2O3对HL-60细胞hTERT蛋白表达的影响
　　4.1.不同浓度的西达本胺单药组、AS2O3单药组作用于HL-60细胞48h后，随着药物作用浓度递增， hTERT蛋白表达逐渐下降，西达本胺作用于HL-60细胞48h后，hTERT蛋白相对表达量由0.88±0.09下降至0.39±0.03， AS2O3作用于HL-60细胞48小时后，hTERT蛋白相对表达量由0.88±0.02下降至0.40±0.03。通过统计学软件分析，对照组、不同处理组相互之间差异均具有统计学意义(P=0.00)。说明单药西达本胺、AS2O3均能降低hTERT蛋白的表达水平，且呈剂量依赖性。(Fig.7, Fig.8, Table10, Table11)
　　4.2.不同浓度的西达本胺联合AS2O3对HL-60细胞作用48h后，低浓度两药联合hTERT蛋白表达量为0.63±0.05，高浓度两药联合hTERT蛋白表达量下降到0.17±0.02，随着药物浓度的增加，hTERT蛋白表达量逐渐下降，联合组与单药组及对照组比较，hTERT蛋白表达量下降明显，差异均具有统计学意义(P=0.00)。说明西达本胺联合AS2O3能够协同降低HL-60细胞hTERT蛋白的表达水平。(Fig.9, Table12)
　　结论：
　　1.西达本胺和三氧化二砷单药均能对HL-60细胞产生诱导凋亡及抑制增殖的作用，且具有时间、剂量依赖性。
　　2.西达本胺和三氧化二砷具有协同作用，可加强抑制HL-60细胞的效果。
　　3.西达本胺、三氧化二砷单药及联合均可抑制HL-60细胞增殖，诱导其凋亡，与hTERTmRNA及hTERT蛋白表达受抑制，下调端粒酶活性有关，提示hTERTmRNA表达受抑可能是西达本胺和三氧化二砷发挥肿瘤抑制及促进肿瘤凋亡的作用靶点。

目录

声明

英文缩写

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

3 统计学处理

结果

1 CCK8法检测西达本胺及AS2O3对HL-60细胞的增殖抑制作用

2 FCM检测西达本胺及AS2O3对HL-60细胞凋亡的影响。

3 RT-PCR法检测西达本胺及AS2O3对HL-60细胞hTERTmRNA表达水平的影响。

4 Western Blot(蛋白印迹)方法检测西达本胺及AS2O3对HL-60细胞hTERT蛋白表达水平的影响。

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述:急性髓系白血病治疗新方向：组蛋白去乙酰化酶抑制剂联合三氧化二砷

致谢

个人简历