利拉鲁肽对体外诱导的非酒精性脂肪肝细胞内质网应激的作用

摘要

目的:通过观察胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体激动剂利拉鲁肽干预治疗体外诱导的非酒精性脂肪肝细胞模型的内质网应激相关指标GRP78蛋白表达、ATF6核蛋白水平和caspase12的变化，探讨利拉鲁肽对NAFLD肝细胞抗内质网应激作用及细胞凋亡的机制。
　　方法:
　　1.体外诱导非酒精性脂肪肝细胞模型：体外用含10％胎牛血清（FBS）的DMEM培养液培养人正常肝细胞L02细胞，加入油酸、棕榈酸（2:1）诱导肝细胞脂肪变性，建立非酒精性脂肪肝（NAFLD）细胞模型。
　　2.细胞分组及干预：1）正常对照组；2）NAFLD细胞模型组；3）NAFLD细胞模型+利拉鲁肽+高脂培养液组：高脂培养液中加入浓度为10nmol/L利拉鲁肽；4）NAFLD细胞模型+利拉鲁肽+正常培养液组：正常培养液中加入浓度为10nmol/L利拉鲁肽；5）正常细胞+利拉鲁肽组：正常培养液中加入浓度为10nmol/L利拉鲁肽；各组分别干预48h，收集样品。检测细胞内脂肪含量与代谢水平。
　　3.应用全自动生化仪检测细胞内甘油三酯（TG)的含量及上清中丙氨酸氨基转移酶(Alanine Aminotransferase, ALT)，采用油红“O”染色法测定细胞内脂滴情况。
　　4.检测氧化应激有关的指标MDA和SOD的水平。
　　5.采用qRT-PCR与Western blotting检测内质网应激相关指标GRP78蛋白表达以及下游ATF6核蛋白水平和细胞凋亡指标caspase12的变化。
　　6.采用TUNNEL分析法检测细胞凋亡的变化。
　　7.数据分析：所得数据采用SPSS23.0软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准差表示。实验数据均进行正态分布检验及方差齐性检验，符合正态分布的采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，不符合正态分布的采用K-W秩和检验。以P<0.05认为差异有统计学意义。
　　结果:
　　1.利拉鲁肽对正常L02细胞的TG、ALT水平、SOD活性、MDA含量、GRP78、ATF6、caspase12mRNA和蛋白表达无明显影响（P＞0.05）。
　　2.与正常对照组比较，NAFLD组细胞内脂滴明显增多，TG、ALT水平升高，SOD活性降低，MDA含量升高，GRP78、ATF6、caspase12 mRNA和蛋白表达均增高，凋亡指数增加，差异均有显著性（P＜0.05）。
　　3.与NAFLD细胞模型组比较，NAFLD细胞模型+利拉鲁肽治疗+高脂培养液组、NAFLD细胞模型+利拉鲁肽治疗+正常培养液组细胞内脂滴明显减少，TG、ALT水平下降，SOD活性升高，MDA含量降低，GRP78、ATF6、caspase12 mRNA和蛋白表达减少，凋亡指数下降，差异均有显著性（P＜0.05）。
　　4.与NAFLD细胞模型+利拉鲁肽治疗+正常培养液组比较，NAFLD细细胞胞模型+利拉鲁肽治疗+高脂培养液组内脂滴减少幅度较低，TG、ALT水平下降幅度减少，SOD活性上升幅度降低，MDA含量下降幅度减少，GRP78、ATF6、caspase12 mRNA和蛋白表达、细胞凋亡指数水平下降幅度较低，差异均有显著性（P＜0.05）。
　　结论:
　　1.高脂环境下，肝细胞凋亡的增加，而利拉鲁肽可以对抗肝细胞凋亡。
　　2.GLP-1受体激动剂利拉鲁肽可减轻肝细胞内脂质沉积，改善肝细胞功能。
　　3.GLP-1受体激动剂利拉鲁肽可能通过下调GRP78、ATF6核蛋白的表达减少内质网应激，维持细胞稳态，进而使caspase-12的表达减少抑制肝细胞凋亡，对非酒精性脂肪肝起到治疗作用。

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中文摘要

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前言

材料与方法

1 材料与仪器

2实验方法

3 统计学处理

结果

1 诱导L02细胞脂肪变性成功

2 细胞培养上清中肝酶ALT和细胞内 TG 检测结果

3 氧化应激指标SOD活性、MDA测定结果

4 RT-PCR 结果

5 Western Blot 结果

6 TUNNEL法检测肝细胞凋亡

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述: GLP-1及其类似物在NAFLD治疗中作用的进展

致谢

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