线粒体编码区COⅠ、COⅡ、COⅢ基因单核苷酸多态性与乳腺癌的发病风险的相关性研究

摘要

目的：乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，根据世界卫生组织公布的数据，显示乳腺癌在全世界女性中的发病率排名第一，死亡率列恶性肿瘤第五位;中国肿瘤登记点公布的数据显示乳腺癌是中国女性发病率最高的恶性肿瘤，死亡率位居第六。乳腺癌是一种多基因、多因素和多阶段累计的过程，呈现明显的家族聚集性，其中基因改变被认为是乳腺癌发生的基础。不同于核DNA（nuclear DNA），线粒体DNA（mitochondrial DNA）缺乏组蛋白的保护、修复能力差以及处于富含活性氧（简称 ROS）的环境中，因此易于产生氧化应激损伤，从而易于发生基因改变。针对线粒体基因与乳腺癌发病风险的相关性，众多学者展开了大量的研究工作，研究结果表明表明线粒体 D-loop区基因多态性与乳腺癌的发病风险具有相关性。线粒体基因 D-loop区通过影响线粒体基因的转录及复制而改变线粒体基因，而线粒体基因编码区因其几乎不含有内含子，故线粒体编码区基因的单核苷酸多态性可通过改变编码的氨基酸类型从而改变线粒体功能。因此，开展线粒体编码区基因与乳腺癌发生、发展的相关性研究具有重要的意义。本研究中选择线粒体编码区基因为研究对象，主要检测区域为线粒体编码区基因 COX，选取外周静脉血液样本，进行测序并与标准序列进行对比找到多态性位点，运用 KW与卡方检验探究多态性位点、多态性频次与乳腺癌发病风险的相关性，为解决乳腺癌发病风险评估方法提供了一种新的思路。
　　方法：
　　1.线粒体DNA的提取，所有患者均为女性，既往无乳腺及其他恶性肿瘤病史，且均为非孕期。所有入组患者均于2008年1月至2015年10月期间在河北医科大学第四医院乳腺中心就诊。其中本次实验入组的散发性乳腺癌患者为161名，家族性乳腺癌患者为67名，所有患者均经病理证实为乳腺癌。家族性乳腺癌的一级亲属共41名，此外还有161名正常对照组，均为在河北医科大学第四医院体检中心体检的无乳腺疾病的健康人，乳腺疾病包括良性和恶性乳腺疾病。
　　2.目的基因检测，PCR扩增产物测序，在网站获取剑桥标准人类线粒体DNA序列,然后利用两款软件进行DNA序列分析。首先应用DNAMAN序列分析软件，将各实验组的血线粒体DNA目的基因段与以获取的标准序列进行多序列对比分析，找出提示的突变位点。然后在 Chromas软件中找到相对应的突变位点，再次确认是否发生突变，并记录下来。
　　3.统计、分析，把经过对比分析的资料，进行仔细、严密的汇总。内容主要包括有多少突变位点，以及每一个突变位点在各实验分组中的人员配比情况，列出相应的表格。采用卡方检验（χ2检验，PearsonChi-Squaretest)对各组资料的构成比进行分析。要求理论频数不应小于5。当有1=<理论频数<5时，运用连续性校正卡方检验，当理论频数小于1时，运用确切概率法计算概率。多态性位点分布频次的分析采用Kruskal-WallisH检验，对样本总体进行检验，如果 P<0.05，样本总体具有统计学差异，再使用nemenyi继续4组间分析，P<0.0126，具有统计学差异。所有的数据应用SPSSversion21统计软件进行统计分析，P<0.05被认为是有统计学意义。
　　结果：
　　1.临床资料分析，各组间年龄的比较未见明显差异，提示各组间年龄均衡，其他实验数据具有可比性。对于家族和散发性乳腺癌组患者的临床资料进行对比，两组的病理类型（P=0.013）有统计学差异，其中髓样癌（P=0.012）、浸润性小叶癌（P=0.045），家族性乳腺癌患者以上类型肿瘤发生率较散发性乳腺癌高，提示家族性乳腺癌患者病理类型恶性程度更高。其余的临床资料，分别包括临床分期（P=0.436）、淋巴结转移（P=0.069）、绝经情况（P=0.152）、HER-2的表达（P=0.218）及激素受体的表达情况（P=0.847），均无明显统计学差异，提示本组研究中的散发性和家族性患者的临床生物学特性相匹配。
　　2.线粒体基因编码区 COⅠ、COⅡ、COⅢ基因多态性改变与乳腺癌发病风险的相关性分析。
　　各实验组的多态性改变经过统计学分析，运用卡方检验（χ2检验， PearsonChi-Squaretest)计算出P值，P<0.05被认为有统计学意义，可以考虑这个位点的多态性改变与乳腺癌的发病风险相关。
　　2.1散发乳腺癌组与正常对照组统计学分析，在线粒体基因编码区COⅠ基因上，散发性乳腺癌组与正常对照组相比7196C/A位点（P=0.034）存在多态性，具有统计学差异。在线粒体基因编码区COⅢ基因上，散发性乳腺癌组与正常对照组比较，9545A/G（P=0.036）、9548G/A（P=0.003）位点存在多态性，具有统计学意义，提示这些位点多态性可能与乳腺癌的发病风险具有相关性。
　　2.2在9548G/A位点，家族性乳腺癌组与对照组比较，此位点多态性发生率高，具有统计学差异，但与散发性乳腺癌组对比，发生率无明显差别，无明显统计学差异，提示此位点的多态性可能仅与乳腺癌的发生、发展有相关性。
　　3.各实验组的线粒体基因 COⅠ（5904~7445base）、COⅡ（7586~8269base）、COⅢ（9207~9990base）每个样本多态性位点频次分布与乳腺癌发病风险。
　　分为两组进行比较，均采用 Kruskal-WallisH检验，对样本总体进行检验（P<0.05视为具有统计学差异），Nemenyi（4组间比较α=0.125）数据结果提示散发性乳腺癌组、家族性乳腺癌组、一级亲属组多态性频次分布在引物4和6号组较正常对照组均有统计学差异，均高于健康对照组。但散发性乳腺癌与家族性乳腺癌之间、散发性乳腺癌和一级亲属及家族性乳腺癌和一级亲属组多态性频次无明显统计学差异。提示线粒体基因氧化损伤在散发性乳腺癌及家族性乳腺癌亲属中的累积高于正常对照组。
　　结论:
　　1.COⅠ、COⅡ、COⅢ基因的检测中，发现7196C/A位点、9545A/G、9548G/A与散发性乳腺癌的发病风险具有相关性，增加了散发性乳腺癌的发病风险。
　　2.9548G/A位点可能同时增加了家族性和散发性乳腺癌的发病风险。
　　3.在线粒体编码区COX基因的7100-7700bp及9300-10000bp基因片段上，散发性和家族性乳腺癌及其一级亲属的单核苷酸多态性分布频次较正常对照组高，提示肿瘤细胞内线粒体的损伤积累较快、较多，也提示细胞内的氧化损伤与乳腺癌的发病风险具有相关性。

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前言

材料与方法

1 研究对象

2 实验试剂、器材及来源

3 实验总体步骤

结果

1 临床资料

2 线粒体多态性与乳腺癌发病风险的关系

3 线粒体基因突变频次与乳腺癌发病风险的关系

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述: 线粒体与乳腺癌的相关性研究

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