SUMS0382申克孢子丝菌生物学特性及免疫正常动物模型建立的初步研究

摘要

孢子丝菌病是一种皮肤、皮下组织及其附近淋巴系统的亚急性或慢性真菌感染，有时可波及各脏器。其致病菌申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii，简称Sschenckii)广泛存在于自然界，尤其是热带和亚热带地区，中国亦为高发地区。 S．schenckii的形态特征是与其它双相型真菌鉴别的重要依据，同时与其致病性关系密切。其在25℃生长状态为菌丝相，表现为淡褐色至深褐色或黑色菌落，有皱褶或沟纹，可见灰白色短绒毛状菌丝，镜下可见纤细分支分隔菌丝，生孢子梗位于菌丝两侧直角长出，呈梅花朵样或“套袖”状排列；37℃为酵母相，表现为白色至灰黄色酵母样菌落，镜下可见圆形、长形或者梭形孢子，有出芽。双相型转化是S．schenckii的重要特征之一，转化条件较复杂，存在菌株特异性，并且与菌株的毒力相关。S．schenckii侵入宿主后，通过一系列的形态学改变来适应宿主的内环境，造成组织损伤，抵抗宿主免疫杀伤。目前大多数学者认为酵母相是S．schenckii的致病形态。 孢子丝菌病呈慢性病程，发病部位皮肤组织纤维化导致其治疗周期长，费用高，而且已有对两性霉素B治疗失败的报道，亦有对伊曲康唑MIC值较高的报道，因此有必要进行体外药敏试验及耐药菌株的临床监测。《美国传染病协会2007版孢子丝菌病临床治疗指南》推荐，伊曲康唑作为非系统性孢子丝菌病的首选单独治疗药物，很多学者亦尝试了联合治疗，并取得一定疗效。而与之相关的体外药敏试验仍处于探索阶段，由于影响因素较多，哪一种生长形态的药敏试验结果更为准确可靠、并用以指导该病治疗尚存争议。目前尚无S．schenckii对伊曲康唑耐药的报道，亦无相关药敏试验耐药标准的报道，对其耐药机制需进一步探讨。 尽管很多学者通过建立动物模型的方式，对S．schenckii的致病性、宿主免疫反应及治疗方面进行了探讨，但迄今为止仍未有明确的阐述。动物模型的建立是由宿主和受试菌株共同决定的，影响因素较多，既往文献报道动物模型多是在免疫抑制基础上建立的，既不能反应疾病的自然进程，也不能反应宿主的正常免疫作用。因此建立理想的孢子丝菌菌病动物模型，模拟自然发病过程，对该疾病发病机制的阐明及治疗药物的疗效评价具有重要意义。本课题拟通过对分离自1例伊曲康唑治疗失败的孢子丝菌病患者的临床菌株SUMS0382的生物学特性及所建立的相应慢性皮肤感染动物模型进行研究，有助于阐述S．schenckii的致病性。 第一部分：SUMS0382申克孢子丝菌的生物学特性研究 目的：探讨SUMS0382申克孢子丝菌的酵母相转化条件、生长抑制温度及体外药敏试验，进一步明确其真菌生物学特性。 方法：1.酵母相转化。将实验菌株传代活化2次后，超净工作台内，挑取生长良好的菌落团块，采用划线接种法，接种于BHIA+5％羊血斜面试管和BHIA+0.5％GS余面试管，各2管，置CO2恒温温箱35℃培养。必要时连续传代，直至转化成功，获得灰白色酵母型菌落。2.温度生长抑制试验。将酵母相实验菌株，采用划线接种法，接种于SDA平板、PDA平板、BHIA平板、BHIA+5％羊血平板和BHIA+0.5％GS平板，各2个，分别置35℃、36℃、37℃和38℃CO2恒温温箱培养14d，观察各菌株生长情况，记录各实验菌株的停止生长温度。3.伊曲康唑和特比萘芬体外联合药敏试验。活化菌株，分别制备菌丝相和酵母相菌悬液，菌丝相浓度调整至5×104 CFU/ml(2倍终浓度)，酵母相调整至2.5×103 CFU/ml(2倍终浓度)；采用微量液基稀释法加样制板后，菌丝相置25℃，酵母相置35℃孵育，第5d观察结果。结果判断标准为各药的MIC终点为100％生长抑制，联合用药效果评价采用分数抑菌浓度指数评价。4株菌均进行3次重复试验。 结果：1.通过连续传代，成功获取4株申克孢子丝菌的酵母相。2.SUMS0382、BMU02035和SUMS0383在35℃和37℃生长较好，36℃生长差，38℃时停止生长，BMU00471均生长良好。3.体外联合药敏试验显示伊曲康唑和特比萘芬不论单独应用还是联合应用，菌丝相GM值均高于酵母相；两药相互作用结果显示：菌丝相时，SUMS0383和BMU00471显示相加作用，SUMS0382和BMU02035显示无关作用；酵母相时，SUMS0382、SUMS0383和BMU02035显示相加作用，BMU00471表现为无关作用。 结论：1.该菌株酵母相转化需要富含营养的培养基，连续传代，35℃是适宜温度。2.菌株SUMS0382的生长抑制温度为38℃。3.生长时相对S．schenckii MIC值有明显影响，体外联合药敏试验是可行的。 第二部分：SUMS0382申克孢子丝菌慢性皮肤感染Wistar大鼠模型的建立 目的：观察免疫正常Wistar大鼠皮肤型孢子丝菌病的发病过程，探讨其慢性皮肤感染动物模型建立的可行性及实验条件。 方法：1.实验动物。42只Wistar大鼠，雌雄各半，体重90-100g。2.实验性感染。采用化学脱毛法于大鼠背部脱毛，脱毛区约3cm×3cm。水合氯醛腹腔麻醉后，采用皮下注射法，在脱毛区注射孢子丝菌SUMUS0382菌悬液0.1ml，约含1×107个孢子，分3点接种，拔针时，轻按针孔片刻，防止菌液逸出。3.发病情况观察。自接种之日起，每日观察大鼠的生长发育情况(体重、存活率)及发病情况(皮损形成时间，结节、糜烂、溃疡、结痂等)，观察时间为12w。4.组织培养与组织病理。接种后4w、8w、12w各取2只发病大鼠，切取结节后，分为两部分，一部分用10％福尔马林固定，石蜡切片，分别行HE和PAS染色，镜下观察组织病理变化；另一部分无菌操作下剪碎组织，接种沙氏培养基(SDA)和脑心浸汁羊血培养基(BHIA)，分别置25℃和35℃培养。 结果：1.接种2w后可见结节长出，4w时有结节老鼠数量最多，随后部分结节可消退，未消退者结节缓慢增大，主要局限于接种点。其中一只大鼠70d时皮损出现化脓，溃疡。观察期内，所有大鼠生长发育好，未出现死亡。2.第4w、8w、12w皮损组织SDA25℃培养，可见典型菌落，且色素较原菌株加深；BHIA35℃培养，可见酵母型菌落。3.三个观察时段组织病理均可见感染性肉芽肿，呈现典型的“三带现象”。4w，8w时PAS染色均可见圆形、卵圆形孢子，但8w时孢子数较前减少，12w时炎细胞浸润更加明显，但PAS染色未见有孢子。 结论：1.免疫正常Wistar大鼠慢性皮肤感染S．shenckii动物模型的建立是可行的。2.模型形成时间为第4w，皮下注射是有效途径。

目录

文摘

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论文说明:英文缩略词

声明

前 言

第一部分 SUMS0382申克孢子丝菌的部分生物学特性研究

1.1材料与方法

1.2结果

1.3讨论

1.4结论

第二部分Wisatar大鼠慢性皮肤感染SUMS0382申克孢子丝菌动物模型的建立

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

2.4结论

第三部分小结与展望

参考文献

附录一 在学期间科研成绩

附录二综述 申克孢子丝菌体外药敏试验研究进展

致谢