系统性硬皮病成纤维细胞表型的Logistic回归分析及Smad7基因启动子甲基化状态的相关研究

摘要

第一章系统性硬皮病患者皮损成纤维细胞系的建立、鉴定及生长特性研究 目的：建立原代培养系统性硬皮病患者皮肤成纤维细胞的稳定方法，对体外培养的成纤维细胞进行鉴定，并初步研究成纤维细胞的体外培养的生长特性，为后阶段实验建立坚实基础。 方法：采用组织块法原代培养皮肤成纤维细胞；倒置光学显微镜观察成纤维细胞生长形态，同时结合免疫细胞化学方法对细胞进行鉴定；采用MTT法测定体外培养的成纤维细胞生长曲线。 结果：皮肤成纤维细胞约1周左右从组织块周围爬出，约3周左右时间可成功传代；培养细胞呈梭形，细胞排列极性明显，呈放射状或漩涡状，免疫细胞化学显示波形蛋白染色阳性，角蛋白染色阴性，培养细胞鉴定为成纤维细胞；MTT法测皮肤成纤维细胞生长曲线显示，细胞生长曲线呈现“S”型，细胞生长状态良好，适合下一步实验。 结论：体外成功培养系统性硬皮病皮肤成纤维细胞，符合成纤维细胞鉴定标准，成纤维细胞生长状态良好，为我们进行下阶段实验保证了充足实验材料。 第二章系统性硬皮病患者皮损成纤维细胞表型的Logistic回归分析 背景与目的：系统性硬皮病患者皮损成纤维细胞在体外培养时可展现出胶原蛋白分泌过高的硬皮病表型，具有硬皮病表型的成纤维细胞也成为系统性硬皮病研究的最重要材料之一。但是，并不是所有来自患者皮损的成纤维细胞均表现出硬皮病表型，而目前极少前瞻性的资料可协助研究者预估皮损成纤维细胞硬皮病表型的发生概率。因此，我们开展前瞻性研究对系统性硬皮病成纤维细胞表型进行Logistic回归分析，寻找相关的预测因子，建立预测模型。 方法：招募15名系统性硬皮病患者，记录其临床与实验室资料，进行Rodnan皮损评分(TSS)、病情活动度评分(VDAI)、病情严重度评分(MDSS)等评估，进行组织HE染色病理检查，同时通过原代培养建立皮损成纤维细胞系。采用实时定量RT—PCR检测成纤维细胞前胶原蛋白1α2转录水平。最后，使用Logistic回归分析各细胞系资料。 结果：8例系统性硬皮病成纤维细胞系表现出胶原分泌过高的硬皮病表型。Logistic回归分析得出模型Y＝—9.718+2.525X7，X7代表病情活动度评分(VDAI)。组织病理结果显示，系统性硬皮病表型与血管周围白细胞浸润呈正相关关系。 结论：建立了系统性硬皮病患者皮损成纤维细胞表型预测模型Y=—9.718+2.525X7。本实验显示系统性硬皮病皮损成纤维细胞表型与病情活动度呈正相关关系。当研究者欲获得具有硬皮病表型的成纤维细胞系时，可利用该模型进行评估，以预先估计高胶原分泌成纤维细胞系的发生概率。 第三章系统性硬皮病成纤维细胞甲基化相关因子的表达和5-氮杂—2-脱氧胞苷对系统性硬皮病成纤维细胞胶原蛋白及相关因子表达的影响 背景与目的：近年来，表观遗传学中的DNA甲基化等成为许多生命科学研究的前沿与热点，在硬皮病等多基因疾病的相关研究中显示出巨大潜力。本实验拟检测系统性硬皮病成纤维细胞甲基化相关因子的表达情况，探讨5-氮杂—2-脱氧胞苷对系统性硬皮病成纤维细胞胶原蛋白及相关因子表达的影响。 方法：采用实时定量RT—PCR技术，分别测定系统性硬皮病组和对照组皮肤成纤维细胞系甲基化相关因子Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、MBD1、MBD2、MeCP2、Kaiso等的mRNA表达水平；然后，使用甲基转移酶5-氮杂—2-脱氧胞苷对体外培养的皮肤成纤维细胞进行72小时干预；最后，检测系统性硬皮病组成纤维细胞在5-氮杂—2-脱氧胞苷干预前后Collα2、TGF—β1、Smad7等基因mRNA表达水平。 结果：与健康对照组比较，系统性硬皮病成纤维细胞Dnmt1、Collα2、TGF—β1基因mRNA表达增高，Smad7基因mRNA表达减少(P<0.05)。5-氮杂—2-脱氧胞苷处理后，系统性硬皮病成纤维细胞Collα2、TGF—β1基因转录水平回落，而Smad7基因表达也上升至正常范围。 结论：系统性硬皮病成纤维细胞存在甲基转移酶表达异常，Dnmt1等表观遗传机制可能参与了系统性硬皮病发病过程，Dnmt1抑制剂5-氮杂—2-脱氧胞苷可能成为系统性硬皮病治疗的新选择。 第四章系统性硬皮病成纤维细胞Smad7基因启动子甲基化状态的相关性研究 背景与目的：前阶段研究显示，系统性硬皮病成纤维细胞甲基转移酶1表达增高；当使用甲基转移酶抑制剂5-氮杂—2-脱氧胞苷对硬皮病成纤维细胞进行干预时，原本低表达的Smad7基因出现转录增加，同时胶原蛋白与TGF表达回落。研究提示系统性硬皮病Smad7基因低表达的致病机制可能有甲基化过程参与。因此，本阶段实验拟检测系统性硬皮病组与正常对照组Smad7基因启动子区域的甲基化状态，分析其与疾病发生的可能关系。 方法：首先，应用MethPrimer软件分析Smad7基因启动子区域CpG位点分布情况，对CpG岛进行预测，同时设计引物。接着，采用巢式PCR和降落PCR技术，对重亚硫酸盐修饰法处理的DNA进行扩增，PCR产物经纯化回收后克隆测序，使用QUMA软件分析结果。最后，甲基化特异性PCR(MSP)对多细胞系相应CpG位点进行检测，实时定量RT—PCR检测各细胞系Smad7转录情况，分析可能关系。 结果：在Smad7启动子-1～-1000bp区域预测到两个甲基化岛；重亚硫酸盐测序PCR(BSP)检测显示系统性硬皮病组与健康对照组相应启动子区域甲基化状态存在统计学差异，其中第—851，—819位CpG位点的甲基化状态差异显著，P<0.05；甲基化特异性PCR(MSP)显示Smad7基因启动子区域的甲基化状态与Smad7基因的转录水平存在负相关关系。 结论：系统性硬皮病成纤维细胞存在Smad7基因启动子区域甲基化水平的异常；Smad7基因启动子高甲基化参与了系统性硬皮病成纤维细胞Smad7基因低表达的致病机制。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一章系统性硬皮病皮损成纤维细胞系的建立、鉴定及特性研究

第二章系统性硬皮病皮损成纤维细胞表型的Logistic回归分析

第三章系统性硬皮病成纤维细胞甲基化相关因子的表达和5-氮杂-2-脱氧胞苷对系统性硬皮病成纤维细胞胶原蛋白及相关因子表达的影响

第四章系统性硬皮病成纤维细胞Smad7基因启动子甲基化状态的相关性研究

第五章总结与展望

参考文献

附录

致谢