重型肝炎相关基因启动子甲基化状态检测的方法及试剂盒

摘要

本发明涉及一种重型肝炎相关基因启动子甲基化状的检测的方法和试剂盒。它设有使非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的试剂，2×Taq PCR MasterMix，以及针对人谷胱甘肽硫转移酶P1基因的启动子甲基化特异性和非甲基化特异性的引物对。将提取的外周血单个核细胞DNA进行修饰后，使其与启动子的甲基化(M)特异性和非甲基化(U)特异性引物、2×Taq PCR MasterMix、双蒸馏水进行混合，并产生甲基化特异性聚合酶链式反应，得到扩增产物，检测其甲基化状态，有助于临床医生判定重型肝炎患者的病情和进行治疗。

说明书

所属技术领域

本发明涉及医学领域，是一种重型肝炎相关基因启动子甲基化状态信息及其应用。具体地说是检测与重型肝炎相关的基因启动子甲基化状态的方法和试剂盒。

背景技术

慢加急性重型肝炎(ACHBLF)是在慢性肝病的基础上，由多种因素引起的严重肝损害，导致肝脏的合成、排泄、生物转化和解毒等功能发生严重障碍，出现以黄疸、凝血功能障碍、肝性脑病、以及腹水等为主要表现的一组临床症候群。我国是乙型病毒性肝炎的高发区，其乙型肝炎表面抗原(HBsAg)携带率达10％，现患者约3000多万，其中60％以上为慢性乙型病毒性肝炎(CHB)。这些携带者和慢性肝炎患者常有恶化或发展成重型肝炎的可能，因此，在我国，乙型肝炎病毒(HBV)感染是引起慢加急性重型肝炎的主要病因。据统计，由乙型肝炎病毒致重型肝炎占重型肝炎的81％。在乙型肝炎病毒感染基础上发生的慢加急性重型肝炎常称为慢加急性重型乙型病毒性肝炎。在我国，慢加急性肝衰竭不仅发病率高，而且病情复杂，病情凶险，发展迅速，预后不良，常出现各种并发症，严重危及患者的生命。所以研究慢乙肝的防治及防止慢乙肝向慢重肝、肝硬化甚至肝癌转变具有十分重要的意义。

慢加急性肝衰竭的发病机制非常复杂，迄今为止还远远未能阐明。目前与HBV相关性疾病研究的有关的疾病主要有HBV相关性肝炎、肝硬化和肝癌。随着基因启动子区甲基化与各种肿瘤包括肝癌的相关性研究增多，甲基化成与HBV相关性疾病研究的有关的疾病主要有HBV相关性肝炎、肝硬化和肝癌。随着基因启动子区甲基化与各种肿瘤包括肝癌的相关性研究增多，甲基化成为研究的越来越多的表观遗传学内容。有研究指出，HBV感染机体导致相关性肝脏疾病的发生可能与某些基因的过甲基化有关。

HBV是一种嗜肝病毒，感染肝细胞后，HBV-DNA可与宿主肝细胞发生整合，从而使宿主的基因组发生广泛的改变，包括缺失、易位、转录产物的融合和广泛的基因组不稳定。病毒进入机体诱导宿主甲基化转移酶(DNMT)活性增加，可催化病毒脱氧核糖核酸(DNA)启动子甲基化。在病毒基因被甲基化的同时，由于活性增加的甲基化转移酶同时也可对宿主的基因发挥甲基化修饰作用，因此人体正常DNA也可能被甲基化修饰，从而使宿主本身的基因启动子区也发生过甲基化。

DNA甲基化是表观遗传学上研究最深入的一种机制，它是一种酶介导的化学修饰过程。DNA甲基化是指5-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，在DNA甲基化转移酶的作用下，将胞嘧啶核苷酸的嘧啶环第5位碳原子甲基化，并与其3’端的鸟嘌呤形成甲基化的CpG岛。CpG岛是基因组中长度为300～3000碱基对(bp)的富含CpG二核苷酸的一些区域，主要存在于基因的5′区域。正常情况下，启动子区中CpG岛的未甲基化状态是基因转录所必需的，基因组中绝大多数位点的甲基化状态恒定不变，只有少数位点的甲基化状态可以发生改变，当基因组DNA的甲基化状态发生改变时，会造成机体染色体不稳定或基因表达异常，可导致基因转录被抑制。

因此研究HBV导致的宿主基因甲基化对于减轻HBV导致的肝细胞损伤、减少慢性肝炎向重症肝炎转化、降低HBV相关性肝癌的发生具有重要意义。为研究HBV相关性肝炎、肝硬化、肝癌提供了新的思路。

还原型谷胱甘肽(GSH)是一种能够保护肝脏细胞免受各种因素损伤的重要的酶。还原型谷胱甘肽具有清除自由基、抗氧化、抗炎、解毒、促进胆酸代谢、保护细胞膜、改善肝脏功能、减轻组织损伤和促进组织修复等功能。还原型谷胱甘肽广泛存在于正常细胞内，尤其在肝细胞内含量最为丰富。它参与体内三羧酸循环及糖代谢，能激活多种酶类，从而促使糖、脂及蛋白质的代谢，并直接影响肝细胞的代谢过程。能对抗脂质过氧化，是人体抗氧化系统的重要组成部分，具有保护肝细胞膜、促进肝脏酶活性、清除氧自由基和促进肝脏合成功能等作用。慢性乙型病毒性肝炎肝细胞受损可引起还原型谷胱甘肽缺乏，使肝细胞对氧自由基及其他内外源性物资的清除能力降低，加重肝细胞损伤。临床上常通过补充外源性还原型谷胱甘肽而保护肝脏合成，解毒，灭活激素等功能。还原型谷胱甘肽发挥上述保护肝细胞的作用时要依赖于谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的催化作用，谷胱甘肽巯基转移酶属代谢解毒酶系，主要催化谷胱甘肽和亲电性物质之间的反应。谷胱甘肽巯基转移酶是一种二聚体同工酶，具有强有力的催化作用，能催化底物分子，亲电子中心与还原型谷胱甘肽的轭合，促进其代谢、失活，是体内生物转化最重要的II相代谢酶之一。谷胱甘肽巯基转移酶超家族按其染色体定位和序列同源性，主要分为α、μ、π、θ4个亚家族。谷胱甘肽巯基转移酶亚家族分别参与不同化学物质的代谢，但彼此间底物选择范围可发生部分重叠。其中GSTμ、π、θ的作用尤为突出。谷胱甘肽硫转移酶P1(GSTP1)属于GST-π亚家族。GSTP1基因表达降低时会影响到对谷胱甘肽的催化作用，而GSTP1基因启动子区的CpG岛甲基化即可使GSTP1的表达降低。病毒诱导细胞内DNA启动子甲基化可能是病毒重要的致病机制从而可能使保护肝脏免受损伤的基因如GSTP1表达降低，使GSH功能受损。Wang等的研究发现提示，肝癌组织中GSTP1基因启动子区的甲基化并不是只在肝癌阶段才出现的，而是在肝脏疾病发生的长期演变以及HBV不断作用下发生的。

国内外研究表明，HBV相关性肝癌中存在谷胱甘肽巯基转移酶(GSTP1)基因启动子的超甲基化，但是否在慢性乙型病毒性肝炎和重症肝炎患者中是否也存在甲基化以及是否影响了病情的进展和预后，还未有研究。有关GSTP1启动子的甲基化的既往的文献研究主要与肿瘤的发生有关，比如说肝癌、肺癌和前列腺癌等。有研究发现了肝硬化患者血浆中存在GSTP1启动子区的甲基化。基于以上研究，本发明人首次提出了GSTP1启动子的甲基化与慢加急肝衰竭有关。考虑到GSTP1是一种抗氧化损伤的酶，那么通过启动子区甲基化GSTP1被抑制后，可能会促进氧化应激对肝脏的损伤，而氧化应激与慢加急性肝衰竭相关。这一遗传学改变是一个长期的过程，它可能存在于肝炎到肝硬化肝癌的各个过程中，因此甲基化的异常可能在从慢乙肝到重肝的发病过程中起到一定的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种方便适用的检测重型乙型病毒性肝炎慢加急性肝衰竭相关基因启动子甲基化状态的试剂盒，以及简便可行检测方法，其检测结果为重型肝炎的临床诊治提供科学依据。

本发明是这样实现的，本试剂盒内设有：使非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的试剂，2×Taq PCR MasterMix，以及针对人谷胱甘肽硫转移酶P1(GSTP1)基因的启动子GpG岛甲基化特异性和非甲基化特异性的引物对。

为了方便使用，本试剂盒内还可以设有外周血单个核DNA提取试剂，这样，用一个试剂盒就可以做由采血到重型肝炎相关基因启动子甲基化状态检测的全过程。

为了便于对比，本试剂盒内还可以设有阳性对照和/或阴性对照。

本试剂盒中所述的启动子的甲基化(M)特异性和非甲基化(U)特异性引物对选自下组为：

本试剂盒中，所设有的启动子甲基化特异性引物长度为15-40bp。

本试剂盒中设有的使非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的试剂为亚硫酸氢盐，联苯二酚和氢氧化钠。

2×Taq PCR MasterMix酶中含有甲基化特异性聚合酶链式反应(PCR)耐热聚合酶、三磷酸脱氧核糖核苷、氯化镁、反应缓冲液、甲基化特异性聚合酶链式反应(PCR)反应的增强剂、优化剂以及稳定剂酶。

本发明所述的外周血单个核DNA提取试剂为：柠檬酸钠，氢氧化钠，苯酚，异硫氢酸胍，三氯甲烷，十二烷基肌氨酸钠，乙醇，醋酸钠，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，乙二胺四乙酸(EDTA)和N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-2-乙烷磺酸(HEPES)。

本发明所述的检测重型肝炎相关基因GSTP1启动子甲基化状态的方法为：使非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的试剂将提取的外周血单个核细胞DNA进行修饰；将修饰后的外周血单个核细胞DNA与启动子的甲基化(M)特异性和非甲基化(U)特异性引物、2×Taq PCR MasterMix、双蒸馏水进行混合，使其产生甲基化特异性聚合酶链式反应(PCR)，甲基化特异性聚合酶链式反应(PCR)后所扩增出的扩增产物长度为90-100bp，最后检测各基因启动子甲基化状态，得出检测结果。综合患者谷丙转氨酶(ALT)、血清总胆红素(TBIL)、丙二醛(MDA)水平、凝血酶原活动度(PTA)、血清乙型肝炎病毒定量、终末期肝脏病模型(MELD)评分，提示存在GSTP1基因启动子甲基化的患者在免疫因素的参与下，导致了慢乙肝的肝功的反复损害，有更大的机会发展为慢加急性肝衰竭。

本发明人经过广泛而深入的研究，对多例慢加急性肝衰竭(ACHBLF)及慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者的外周血单个核细胞DNA各种基因启动子的甲基化状态进行了分析，并与患者的肝功能进行相关性分析，主要检测谷丙转氨酶(ALT)、血清总胆红素(TBIL)、丙二醛(MDA)水平、凝血酶原活动度(PTA)、血清乙型肝炎病毒定量、终末期肝脏病模型(MELD)评分。发现人谷胱甘肽硫转移酶P1(GSTP1)基因的启动子甲基化状态与慢加急性肝衰竭的发展存在密切关系，在此基础上完成了本发明，以辅助诊断、指导治疗及提示预后。

本发明人已证明，丙二醛水平与慢加急性肝衰竭患者的终末期肝脏病模型评分存在相关性(r＝0.57，P＜0.01)，这一结果提示慢加急性肝衰竭患者中氧化应激的程度与病情严重程度平行升高，氧化应激参与了慢加急性肝衰竭的发生。还原型辅酶II(NADPH)的氧化所产生的自由基导致的氧化应激可能是慢乙肝发病和进展为慢加急性肝衰竭的原因。根据本发明人的研究，HBV不仅会使氧化损伤加剧，还可能通过甲基化的方式降低抗氧化系统相关的酶如GSTP1的表达。可以推测GSTP1的启动子区甲基化可能参与了慢加急性肝衰竭患者中的脂质过氧化损伤，并加剧了氧化应激对肝细胞的损伤，通过服用抗氧化的药物可能有助于丙二醛高血浆水平的患者的恢复。

总之，我们的结果提示GSTP1启动子区甲基化可加剧慢加急性肝衰竭氧化应激对肝脏的损伤，并且血浆中的丙二醛水平与慢加急性肝衰竭的病情程度相关。对于慢加急性肝衰竭(ACHBLF)及慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者的外周血单个核细胞DNA各种基因启动子的甲基化状态的分析有助于临床医生鉴定慢乙肝患者中可能进展为慢加急性肝衰竭的患者。

附图说明

附图：显示了谷胱甘肽硫转移酶P1(GSTP1)启动子甲基化特异性引物扩增的结果。

图中，1-正常组非甲基化引物扩增条带(U)；2-慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者组非甲基化引物扩增条带(U)；3-慢加急性肝衰竭(ACHBLF)患者组甲基化引物扩增条带(M)；4-阳性对照组甲基化引物扩增条带(M)；5-阳性对照组非甲基化引物扩增条带(U)。

在甲基化与非甲基化特异性引物条件下：正常组和慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者组一般可见非甲基化引物扩增条带(U)，上述两组未见甲基化引物扩增条带(U)。慢加急性肝衰竭(ACHBLF)患者组可见明显甲基化引物扩增条带(M)。试验中阴性对照组应无任何引物扩增条带出现，阳性对照组甲基化(M)与非甲基化(U)引物扩增条带均应出现，阳性对照与阴性对照作为本发明的质量控制，若阳性对照与阴性对照未出现上述相应结果，则表示实验过程或操作有误。

由以上显示的结果表明：1.在慢加急性肝衰竭(ACHBLF)患者中，血清丙二醛(MDA)水平要明显高于慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者(P＜0.01)，甲基化慢加急性肝衰竭(ACHBLF)患者组丙二醛水平明显高于非甲基化组(P＜0.01)，慢加急性肝衰竭(ACHBLF)患者的丙二醛水平与终末期肝脏病模型(MELD)评分相关(P＜0.01)。慢加急性肝衰竭患者中甲基化组中的丙二醛水平要明显高于非甲基化组的血浆水平(P＜0.01)。2.慢加急性肝衰竭(ACHBLF)患者GSTP1基因启动子甲基化情况显示，慢加急性肝衰竭患者中有31.43％发现了甲基化，慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者中有8.57％发现了甲基化，两者之间的差别有统计学意义(χ²＝5.71，P＝0.02)。甲基化组与未甲基化组慢加急性肝衰竭(ACHBLF)患者TBIL水平有显著性差异(P＜0.01)。GSTP1基因启动子的甲基化可增加慢加急性肝衰竭患者肝脏氧化应激损伤，而氧化应激与慢加急性肝衰竭相关。

以上分析表明谷胱甘肽硫转移酶P1(GSTP1)基因启动子甲基化状态与慢加急性肝衰竭存在密切的相关性。综合患者谷丙转氨酶(ALT)、血清总胆红素(TBIL)、丙二醛(MDA)水平、凝血酶原活动度(PTA)、血清乙型肝炎病毒定量、终末期肝脏病模型(MELD)评分，提示存在GSTP1基因启动子甲基化的患者在免疫因素的参与下，导致了慢乙肝的肝功的反复损害，.有更大的机会发展为慢加急性肝衰竭。

具体实施方式

本试剂盒内设有：使非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的试剂，2×Taq PCRMasterMix，以及针对人谷胱甘肽硫转移酶P1(GSTP1)基因的启动子甲基化特异性和非甲基化特异性的引物对。

为了方便使用和对比，本试剂盒内还可以设有外周血单个核DNA提取试剂、阳性对照和/或阴性对照。这样，不但可以用一个试剂盒就可以做由采血到慢加急性肝衰竭相关基因启动子甲基化状态检测的全过程。而且，还可以方便地进行测试结果的阳性对照和/或阴性对照，方便快捷的得出测试结论。

本发明所述的启动子的甲基化(M)特异性和非甲基化(U)特异性引物对选自下组为：

本试剂盒中，所设有的启动子甲基化特异性引物长度为15-40bp。

本发明所述的使非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的试剂为：亚硫酸氢盐，联苯二酚和氢氧化钠。

2×Taq PCR MasterMix酶中含有甲基化特异性聚合酶链式反应(PCR)耐热聚合酶、三磷酸脱氧核糖核苷、氯化镁、反应缓冲液、甲基化特异性聚合酶链式反应(PCR)反应的增强剂、优化剂以及稳定剂酶。

本发明所述的外周血单个核DNA提取试剂为：柠檬酸钠，氢氧化钠，苯酚，异硫氢酸胍，三氯甲烷，十二烷基肌氨酸钠，乙醇，醋酸钠，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，乙二胺四乙酸(EDTA)和N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-2-乙烷磺酸(HEPES)。

本发明所述的检测重型肝炎相关基因GSTP1启动子甲基化状态的方法如下(其中，未注明具体条件的实验方法按照常规的实验条件和方法，或按照制造厂商所建议的条件)：

DNA的提取：从慢加急性肝衰竭(ACHBLF)患者抽取血液后，可以按照下列步骤提取患者的DNA，也可以用其他方法提取DNA。

(1)准备试剂：乙醇，柠檬酸钠，氢氧化钠，苯酚，异硫氢酸胍，三氯甲烷，十二烷基肌氨酸钠，醋酸钠，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，乙二胺四乙酸(EDTA)和N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-2-乙烷磺酸(HEPES)。

(2)TRIzol的配制：将下列试剂混合，并以双蒸水(ddH₂O)定容至2000ml：500ml苯酚，250g异硫氢酸胍，17.6ml的0.75mol/L柠檬酸钠溶液(pH≥7)，26.4ml的10％的十二烷基肌氨酸钠溶液，50ml的2mol/L醋酸钠溶液(pH≥4)；

(3)离心收集细胞，每(5-10)×10⁶外周血单个核细胞加入1ml的TRIzol，反复吸打。室温(15-30℃)放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离；

(4)每使用1ml的TRIzol加入0.2ml三氯甲烷，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟；

(5)2-8℃条件下以10000×g离心力离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层；

(6)移去上层水相，用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA，每使用1ml的TRIzol加0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3分钟，2-8℃不超过2000×g的离心力离心5分钟；

(7)移去上清，用含10％乙醇的0.1mol/L柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。每用1ml的TRIzol加入1ml的0.1mol/L柠檬酸钠(含10％乙醇)，室温放置30分钟，2-8℃2000×g的离心力离心5分钟，弃上清，重复一次；

(8)用75％乙醇再洗一遍DNA沉淀，每用1ml的TRIzol加入1.5ml-2ml的75％乙醇，室温放置10-20分钟(不时颠倒混合)2-8℃条件下2000×g离心5分钟，弃上清液；

(9)室温放置5-15分钟晾干DNA，用8mmol/L氢氧化钠溶解DNA。从10⁷个细胞中分离的DNA溶于300--600μl的8mmol/L氢氧化钠，DNA的浓度通常为0.2-0.3μg/μl。溶解DNA后可用Tris-EDTA溶液及HEPES调节pH至7.5左右，获得样本外周血单个核细胞提取的的DNA。

重型肝炎相关基因GSTP1启动子甲基化状态的检测：

1、使非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的试剂修饰DNA

(1)将样本外周血单个核细胞提取2μg的DNA，置于1.5ml的EP管中使用双蒸水稀释至50μl；

(2)加5.5μl新鲜配制的3mol/L氢氧化钠，42℃水浴30分钟；

(3)加30μl浓度10mmol/L的联苯二酚至上述水浴后混合液中；

(4)配制3.6mol/L亚硫酸氢钠，方法如下：1.88g亚硫酸氢钠使用双蒸水稀释，并以3mol/L氢氧化钠滴定溶液至pH 5.0，最终体积为5ml，加520μl至上述水浴后溶液中；

(5)EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液，加200μl石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化，50℃避光水浴16小时；

(6)分光光度计法测DNA浓度和纯度，保存于-20℃。

2、甲基化特异性聚合酶链式反应(PCR)检测各基因启动子甲基化状态

分别用甲基化特异性或非甲基化特异性引物对，对处理过的DNA进行甲基化特异性聚合酶链式反应(PCR)，其中阴性对照中不含有任何DNA底物成分，阳性对照是将体系中DNA底物替换为阳性对照DNA(商品化DNA阳性对照)，浓度为10-20ng/μl。反应体系如下表：

甲基化特异性PCR反应体系

其中，上游引物和下游引物指的是：启动子的甲基化(M)特异性和非甲基化(U)特异性引物对，即：前面所述的M-上游引物、M-下游引物；U-上游引物、U-下游引物。

反应条件如下：加热至95℃，保温5分钟，共1个循环；加热至95℃，保温30秒，在55-60℃的温度下，退火45秒，72℃30秒，40个循环；72℃10分钟1个循环；使甲基化特异性聚合酶链式反应(PCR)后所扩增出的扩增产物长度为90-100bp，1％-1.5％琼脂糖电泳检测扩增产物，获取检测结果。