TLR2/TLR4活化相关微小RNA在人骨髓间充质干细胞迁移、分化中的作用

摘要

背景和目的：间充质干细胞（MSCs）是一种具有自我更新能力和分化潜能的多功能干细胞。Toll样受体（TLRs）是参与天然免疫和获得性免疫的一类重要蛋白子分子。本课题组前期工作证实TLR2及TLR4表达于骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）表面并且可以调节其迁移、分化等多种生物学功能。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长约20-22个核苷酸的RNA分子，能导致靶mRNA降解或翻译受抑制，从而抑制蛋白质合成。近几年研究表明miRNA可以参与MSCs的分化、增殖、迁移、生存以及旁分泌等一系列重要的生物过程。目前已在多种细胞类型中证实TLR信号可调节miRNA的表达，反之miRNA又可作为重要的调节分子调控TLR信号。因此，TLR活化相关miRNA参与调控MSCs的迁移和分化的可能性较大。本课题组前期证实了miR-27b、miR-146a、miR-155和miR-154的TLR2/TLR4活化相关性，提示miR-27b、miR-146a、miR-155和miR-154参与调控BM-MSCs的迁移和分化的可能性较大。鉴于此，本文研究了miR-27b、miR-146a、miR-155和miR-154在BM-MSCs迁移及分化中的作用。
　　方法：分离培养健康志愿者的BM-MSCs，分别用 miR-27b、miR-146a、miR-155和miR-154类似物或抑制剂转染细胞，qRT-PCR（定量实时聚合酶链反应）分别检测转染后细胞相应miRNA的表达量。迁移实验通过观察转染后的细胞迁移情况，测定miR-27b、miR-146a、miR-155和miR-154在细胞迁移中的作用。利用Targetscan version6.2、Miranda、Microcosm Targets Version5三种软件及基因本体论分析miR-155调控细胞迁移可能的靶基因，并利用双荧光素酶报告基因实验进行验证。最后利用Western blotting（免疫印迹实验）检测靶基因相应蛋白的表达进一步证实。分化实验对转染后的细胞进行体外诱导成脂分化及成骨分化，测定miR-27b、miR-146a、miR-155和miR-154在细胞成脂及成骨分化中的作用。
　　结果：用miR-27b、miR-146a、miR-155和miR-154类似物或抑制剂转染细胞后，四种 miRNA表达均出现相应的上调或下调。与对照组相比，转染 miR-27b、miR-146a、miR-155和 miR-154类似物后，相应地 miRNA表达显著上调；转染miR-27b、miR-146a、miR-155和miR-154抑制剂后，相应地miRNA表达显著下调。在迁移实验中，转染miR-155类似物可显著抑制MSCs的迁移，而转染miR-155抑制剂可增强细胞迁移，说明 miR-155抑制细胞迁移。通过靶基因预测软件预测和基因本体论分析后，本课题组认为MYLK可能是miR-155参与调控BM-MSCs迁移的靶基因。双荧光素酶报告基因实验显示miR-155抑制了MYLK双荧光素酶报告载体的荧光活性，从而证实了MYLK是miR-155靶基因。免疫印迹实验结果显示转染miR-155类似物后MYLK蛋白表达下调，转染miR-155抑制剂后MYLK蛋白表达上调，进一步证实了 miR-155通过靶向 MYLK抑制细胞迁移。而转染miR-27b，miR-146a和miR-154类似物或抑制剂后各组细胞迁移无显著差异，说明miR-27b，miR-146a及 miR-154对细胞迁移无明显作用。在分化实验中，转染miR-146a类似物可促进BM-MSCs成脂分化而转染miR-146a抑制剂可抑制其成脂分化，说明miR-146a促进BM-MSCs的成脂分化。而转染miR-27b、miR-155及miR-154类似物或抑制剂后各组细胞成脂分化无显著差异，说明miR-27b、miR-155及miR-154对BM-MSCs成脂分化均无明显作用。另外，转染miR-27b、miR-146a、miR-155和miR-154类似物或抑制剂后各组细胞成骨分化均无显著差异，提示上述四种miRNA对BM-MSCs成骨分化均无明显作用。
　　结论：1. miR-155通过靶向 MYLK抑制BM-MSCs的迁移，miR-27b、miR-146a和miR-154对细胞迁移无明显作用。2. miR-146a可促进BM-MSCs的成脂分化。miR-27b、miR-155和miR-154对BM-MSCs成脂分化均无明显作用。3. miR-27b、miR-146a、miR-155和miR-154对BM-MSCs成骨分化均无明显作用。

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1. 前言

2. 材料与方法

2.1 仪器与试剂

2.2 实验方法

2.3.0 统计学处理

3. 结果

3.1 转染后相应miRNA的表达

3.2 miR-27b、miR-146a、miR-155和miR-154对细胞迁移的作用

3.3 MYLK是miR-155的靶基因

3.4 双荧光素酶报告基因实验证实MYLK为miR-155的靶基因

3.5 miR-155可抑制MYLK蛋白的表达

3.6 miR-27b、miR-146a、miR-155和miR-154对细胞成脂分化的作用

3.7 miR-27b、miR-146a、miR-155和miR-154对细胞成骨分化的作用

4. 讨论

5.结论

参考文献

附录

致谢

综述:微小RNA在间充质干细胞中的作用